可编程的溶瘤病毒疫苗系统及其应用技术方案

本发明专利技术提出了一种表达系统，系统包括：有细胞特异性启动子的第一核酸分子；编码转录激活因子的第二核酸分子；有所述转录激活因子的第一识别序列的第三核酸分子；有第一启动子和第一调控元件的第四核酸分子；编码第一调控蛋白的第五核酸分子；有所述转录激活因子的第二识别序列的第六核酸分子；有第二启动子和第二调控元件的第七核酸分子；编码第二调控蛋白的第八核酸分子；以及：被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达的第九核酸分子；被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达第十核酸分子，其中，第一调控元件适于通过结合第二调控蛋白抑制第一启动子的功能，第二调控元件适于通过结合第一调控蛋白抑制第二启动子的功能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可编程的溶瘤病毒疫苗系统及其应用优先权信息本申请请求2017年03月24日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为201710184736.2的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及表达系统及其应用，更具体地，本专利技术涉及表达系统、重组病毒、重组细胞以及表达系统、重组病毒、重组细胞在制备药物中的用途，进一步地，本专利技术还涉及利用表达系统表达目的蛋白的方法。
技术介绍
溶瘤病毒是指一类具有复制与包装能力实现肿瘤杀伤作用的病毒。目前，多数研究通过改造一些自然界存在的致病力较弱的毒种，使其特异的在肿瘤细胞中表达包装继而实现溶瘤作用。利用溶瘤病毒识别肿瘤细胞的原理主要有两种：第一，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞；第二，选择利用肿瘤特异性的启动子调控病毒关键基因的表达使溶瘤病毒在肿瘤细胞内大量复制并表达毒性蛋白摧毁肿瘤细胞，并/或同时分泌细胞因子刺激自身免疫系统攻击肿瘤细胞。相应的溶瘤病毒无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用，因此溶瘤病毒具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用。近几十年来，溶瘤病毒治疗引起了广泛关注，相关研究取得了巨大进展。目前腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1(herpessimplexvirus-1，HSV-1)、新城疫病毒等相继被改造成溶瘤病毒。2006年，溶瘤腺病毒产品(Gendicine和oncorine)在中国已经用于临床治疗，主要用于治疗头颈部肿瘤、鼻窦癌等。Gendicine和oncorine的原理类似，将人5型腺病毒E1B-55kD区删除，使该病毒可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用。但是，临床数据显示这两种基于单一p53基因突变的溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。美国生物治疗公司Jennerex的JX-594是一种经过修改的牛痘病毒。在2013年完成的二期临床试验中，发现原发性肝癌患者在注射了高剂量的病毒后，其生命延长时间的中间值可达到14.1个月，而接受低剂量注射的患者只有6.7个月的生命延长期。生物技术公司BioVex研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEXGM-CSF已于2015年10月通过了FDA的批准成为美国和欧洲首个上市的溶瘤病毒产品。OncoVex可选择性地杀灭肿瘤细胞同时表达分泌GM-CSF启动机体产生系统的免疫反应杀伤剩余肿瘤细胞及其转移位点。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示50名患者中有26％对治疗有反应，有8名患者完全恢复健康。该公司于2011年被Agmen以10亿美元的价格收购，用于推进三期临床试验。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的治疗数据，临床证明它能成功地让晚期患者的肿瘤缩小，并在超过400名试验患者的III期研究中，Amgen的该药物要比同类其他药物表现得更加出色。综合以上的研究成果可以发现，溶瘤病毒确实是治疗肿瘤的利器，但依然存在着很多的问题。目前已知的人体腺病毒有52种，分别命名为Adl～Ad52，研究中最常用的是Ad2。腺病毒的转录模式具有十分鲜明的特点：已知的腺病毒基因组的转录单位至少有5个：E1区位于病毒基因组左侧，可再分成E1A和E1B，与细胞转化有关；E2区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；E3区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；E4区位于Ad2基因组右端，受E2区编码的DNA结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成Ad2蛋白质Ⅳ。腺病毒基因组进入细胞核后，细胞转录因子首先与E1A区上游的增强子结合，表达E1A蛋白，该蛋白的作用是调节细胞代谢，使病毒DNA更易于在细胞中复制。E1A蛋白还可以激活其他早期基因(E1B、E2A、E2B、E3和E4)的启动子，其中E2B驱动另外三个与病毒复制有关的早期基因转录单位末端蛋白前体(pTP,precursorterminalprotein)、单链DNA结合蛋白(ssDBP,single-strandedDNAbindingproteins)以及DNA聚合酶(DNApol,DNApolymerase)的表达，这三个基因的表达产物紧密地结合成一个复合物，与至少三种细胞蛋白相互作用，启动病毒基因组的复制。通过对腺病毒基因组和转录模式的分析，可以做出以下的改造策略：通过调控E1A的表达来调控腺病毒在靶向细胞中的表复制包装；去除一些病毒包装非必要的基因减少病毒对非靶标细胞的毒性，同时提高病毒的包装容量，如E3，E4等；替换腺病毒的外壳蛋白，改变病毒对特定细胞和组织的靶向性。而现有的溶瘤腺病毒的研究结果显示现有的调控方式存在过于单一，特异性差，安全性低等缺陷，同时腺病毒的改造技术方法比较繁琐。所以如何设计更加严谨安全的调控系统以及如何快速高效的实现溶瘤腺病毒的拼装是设计构建溶瘤腺病毒急需解决的重要问题。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。基于专利技术人实验室的研究基础，专利技术人设计并构建了一个适用于腺病毒调控的可以响应不同微环境的基因线路。在此基因线路中，专利技术人利用了多水平的生物标志物。具体地，第一，利用特异性启动子作为调控基因线路的总开关，即利用特异性启动子调控总激活子的表达，进一步调控腺病毒E1A基因的表达。第二，利用microRNA的靶标序列来响应不同微环境的microRNA的表达特征作为调控基因线路的二级开关。第三，利用闭合基因线路搭建开关系统，闭合的双向抑制型开关可以更高效的响应微环境的变化，同时有效的避免泄露。第四，移除了E1B基因，利用E1B识别P53基因的互补缺失原理进一步提高腺病毒区分肿瘤细胞和正常细胞的能力。第五，移除了E3基因，降低了溶瘤腺病毒对正常细胞的毒害作用同时提高了腺病毒载体的包装容量。同时，2型和5型人腺病毒的基因组长度为36K，如果利用传统单一的质粒构建方式(如酶切连接等)改造腺病毒的难度很大，耗时很长。为了解决这一问题，专利技术人设计了针对本专利技术涉及的基因线路搭建的腺病毒快速构建方法：第一步构建一级元件库，将所需的元件构建到相应的质粒上。一级元件库包括三个库：抑制元件A库主要表达基因线路一侧的抑制元件，腺病毒的E1A基因和与腺病毒共表达的效应因子基因(如免疫因子或杀伤基因)；抑制元件B库主要表达基因线路另一侧的抑制基因，用于调控基因线路的有效翻转，增强开关的安全性；特异性启动子库，通过组织或肿瘤特异性的启动子调控下游基因线路的总开关。第二步，确定生物标志物和表达的效应因子，从一级元件库中挑选相应的质粒，通过GoldenGate的方法快速搭建基因线路。第三步通过Gateway的方式将基因线路整合入已经改造好的腺病毒载体上(去除E1基因，便于实现对腺病毒的人工控制；去除部分E3序列，以扩大包装容量)。溶瘤腺病毒的另一个显著特点就是可以携带并同时表达多个基因，在本专利技术中，专利技术人同时表达了单个或多个细胞免疫相关基因：如IL-2、GM-CSF,、anti-PD-1scFv、anti-PD-L1scFv以及这些因子之间的融合蛋白等。由于携带免疫相关基因，溶瘤病毒在攻击肿瘤细胞的同时会引起系统性的免疫反应，但也存在引起免疫过激反应的风险和隐患。所以携带何种免疫反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达系统，其特征在于，包括:第一核酸分子，所述第一核酸分子含有细胞特异性启动子；第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子；第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列；第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件；第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白；第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件；第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白；以及选自下列的至少之一：第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达；第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，其中，所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.24 CN 20171018473621.一种表达系统，其特征在于，包括:第一核酸分子，所述第一核酸分子含有细胞特异性启动子；第二核酸分子，所述第二核酸分子与所述第一核酸分子可操作地连接，所述第二核酸分子编码转录激活因子；第三核酸分子，所述第三核酸分子含有所述转录激活因子的第一识别序列；第四核酸分子，所述第四核酸分子与所述第三核酸分子可操作地连接，所述第四核酸分子含有第一启动子和第一调控元件；第五核酸分子，所述第五核酸分子与第四核酸分子可操作地连接，所述第五核酸分子编码第一调控蛋白；第六核酸分子，所述第六核酸分子含有所述转录激活因子的第二识别序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子与所述第六核酸分子可操作地连接，所述第七核酸分子含有第二启动子和第二调控元件；第八核酸分子，所述第八核酸分子与第七核酸分子可操作地连接，并且所述第八核酸分子编码第二调控蛋白；以及选自下列的至少之一：第九核酸分子，所述第九核酸分子与所述第五核酸分子可操作地连接，所述第九核酸分子被配置为条件性抑制所述第一调控蛋白的表达；第十核酸分子，所述第十核酸分子与所述第八核酸分子可操作地连接，所述第十核酸分子被配置为条件性抑制所述第二调控蛋白的表达，其中，所述第一调控元件适于通过结合所述第二调控蛋白抑制所述第一启动子的功能，所述第二调控元件适于通过结合所述第一调控蛋白抑制所述第二启动子的功能。2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述细胞特异性启动子为肿瘤细胞特异性启动子，所述肿瘤细胞特异性启动子为选自甲胎蛋白特异性启动子，Survivin基因启动子,人端粒酶逆转录酶基因启动子,胆囊收缩素A受体基因启动子，癌胚抗原启动子，原癌基因人类表皮生长因子受体2启动子，前列腺素内氧化酶还原酶2启动子，趋化因子受体-4，E2F-1基因启动子，黏蛋白启动子，前列腺特异抗原，人酪氨酸酶相关蛋白1，酪氨酸酶启动子至少之一。3.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述转录激活因子为选自Gal4VP16、Gal4vp64、dCas9-VPR、dCas9-VP64、dCas9-VP16、dCas9-VTR以及rtTA至少之一。4.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述第一识别序列与所述第二识别序列分别独立地选自5×UAS,7×tetO以及dCas9的靶标序列至少之一。5.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述第一启动子与所述第二启动子分别独立地选自miniCMV、TATAbox。6.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述第一调控蛋白和第二调控蛋白分别独立地选自Lacl、tetR、zincfinger、KRAB、tetR-KRAB、dCas9-KRAB至少之一。7.根据权利要求6所述的表达系统，其特征在于，所述第一调控元件和所述第二调控元件分别独立地选自tetO、LacO、锌指蛋白靶标序列、dCas9的靶标序列至少之一。8.根据权利要求7所述的表达系统，其特征在于，所述第一调控蛋白是LacI，所述第二调控元件包括多个重复的LacO序列，所述多个重复的LacO序列的至少之一设置在所述第二启动子的下游。9.根据权利要求6所述的表达系统，其特征在于，所述第二调控蛋白是tetR-KRAB所述第一调控元件包括多个重复的tetO序列，所述多个重复的tetO序列的至少之一设置在所述第一启动子的下游。10.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述第五核酸分子和第九核酸分子的至少之一进一步包括编码目的蛋白的序列。11.根据权利要求10所述的表达系统，其特征在于，所述第五核酸分子包括编码所述目的蛋白的序列，并且所述目的蛋白包括选自病毒复制包装蛋白、免疫效应因子的至少之一。12.根据权利要求的11所述的表达系统，其特征在于，所述病毒复制包装相关蛋白包括选自腺病毒E1基因、E1A基因、E1B基因、E2基因和E4基因至少之一。13.根据权利要求11所述的表达系统，其特征在于，所述免疫效应因子包括选自拮抗PD-1基因的抑制序列、拮抗PD-L1基因的抑制序列、拮抗CTLA4基因的抑制序列、拮抗Tim-3基因的抑制序列、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-15至少之一。14.根据权利要求10所述的表达系统，其特征在于，所述目标蛋白与所述第一调控蛋白是以融合蛋白的形式表达的，并且所述目标蛋白与所述第一调控蛋白之间通过可切割的连接肽连接的。15.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述第九核酸分子与所述第十核酸分子分别独立地通过下列方式抑制所述第一调控蛋白或所述第二调控蛋白的表达：借助RNA干扰。16.根据权利要求15所述的表达系统，其特征在于，所述第九核酸分子含有被第一microRNA特异性识别的核酸序列，所述第十核酸分子含有被第二microRNA特异性识别的核酸序列，所述第一microRNA为正常细胞特异性microRNA，所述第二microRNA为异常细胞特异性microRNA。17.根据权利要求16所述的表达系统，其特征在于，所述第一microRNA包括选自下列的至少之一：miR199a、miR95、miR125、miR25b、Let-7、miR143、miR145以及miR200C。18.根据权利要求16所述的表达系统，其特征在于，所述第二microRNA包括选自下列的至少之一：miR21、miR223、miR224、miR221、miR18、miR214、miR146a以及miR1792。19.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子负载在第一表达载体上，所述第三核酸分子、所述第四核酸分子、所述第五核酸分子以及可选的所述第九核酸分子负载在第二表达载体上，所述第六核酸分子、所述第七核酸分子、所述第八核酸分子以及可选的所述第十核酸分子负载在第三表达载体上。20.根据权利要求19所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体分别独立地选自下列的至少之一：质粒、病毒、纳米材料、脂质体、分子耦联载体、裸露DNA、染色体载体、多聚物。21.根据权利要求20所述的表达系统，其特征在于，所述病毒包括选自腺病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒的至少之一。22.根据权利要求19所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体负载在同一个载体上。23.根据权利要求22所述的表达系统，其特征在于，所述同一个载体为腺病毒载体。24.根据权利要求19所述的表达系统，其特征在于，所述第一表达载体包括：从5’端到3’端依次为BsaI，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢震，黄慧雅，刘乙齐，廖微曦，
申请(专利权)人：清华大学，北京合生基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11