重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，所述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体；该方法构建出的重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得重组溶瘤腺病毒，从而能够有效的识别并杀死多种恶性肿瘤的肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。

Recombinant oncolytic adenovirus for preparation of recombinant oncolytic adenovirus vector and its construction method and Application

The invention discloses recombinant oncolytic adenovirus, a recombinant oncolytic adenovirus vector for preparing the recombinant oncolytic adenovirus, a construction method and an application thereof. The construction method of the recombinant adenovirus vector comprises the following steps: introducing a gene encoding RGD peptide into the adenovirus plasmid to form a targeted skeleton plasmid; The gene sequence of tumor stem cell marker ALDH1A1 and the gene sequence of apoptosis-promoting gene PUMA were linked to the first shuttle plasmid to form the second shuttle plasmid; the human telomeric reverse transcriptase promoter was linked to the second shuttle plasmid to form the third shuttle plasmid; the third shuttle plasmid and the targeted cytoskeleton plasmid were in E.coli. The recombinant adenovirus vector was linearized and transfected into the virus packaging cells for packaging, amplification and purification, and then the recombinant adenovirus was obtained, which can effectively identify and kill a variety of malignant tumor stem cells and ordinary tumor cells.

【技术实现步骤摘要】
重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因治疗领域，特别涉及重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类生命的疾病之一，对于多数恶性肿瘤患者而言，可采用化疗、放射疗法及生物免疫治疗等方法来杀死大部分肿瘤细胞，但是却无法从根本上治愈肿瘤，最终肿瘤会复发转移，造成病人死亡，原因是这些常规化疗无法清除具有耐药性的肿瘤干细胞(cancerstemcells,CSCs)，而肿瘤干细胞又具有高致瘤性、自我更新复制和分化的能力，因此肿瘤会复发转移。近年来肿瘤干细胞研究和在肿瘤治疗中的应用研究受到越来越多人的关注，已经在卵巢癌，乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、皮肤癌，甲状腺癌等多种恶性肿瘤中都成功分离出了肿瘤干细胞，并且目前乳醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)的活性已成为多种肿瘤中肿瘤干细胞最具吸引力的标志分子，这些肿瘤包括肺癌，乳腺癌，前列腺癌，甲状腺癌，头颈部癌，卵巢癌等，乳醛脱氢酶家族组成了胞浆内的同工酶类，这些同工酶类负责氧化细胞内的醛类，因此能够将视黄醇氧化为视黄酸，从而影响早期干细胞的分化，目前人类的乳醛脱氢酶超家族包括11个家族4个亚家族，共19个功能性基因，在乳醛脱氢酶庞大的家族和亚家族中，ALDH1A1在多种恶性组织中被证实为肿瘤干细胞的标志分子，ALDH1A1被敲除后肿瘤干细胞失去或降低了其生物学特性如从抗药性变为对抗肿瘤药物敏感，致瘤性显著降低等。随着生命科学和医学研究的不断深入，基因治疗已成为癌症靶向治疗的一个重要发展方向，而溶瘤腺病毒(Oncolyticadenovectors)，又称条件复制型腺病毒载体(Conditionallyreplicatingadenoviruses,CRADs)，介导的基因治疗则是癌症靶向治疗的一个有效策略，溶瘤腺病毒能够在肿瘤细胞中特异性复制并裂解肿瘤细胞，进而释放子代病毒，再感染周围的肿瘤细胞，通过级联放大效应最终消灭肿瘤，它虽然也能感染正常细胞,但是不能在正常细胞中复制，因此对正常细胞的毒性很弱。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供重组溶瘤腺病毒、用于制备该重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其构建方法和应用，从而能够有效的识别并杀死肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞。为实现上述目的，本专利技术提供了一种重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体，其中所述大肠杆菌为大肠杆菌BJ5183。上述RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列的一类短肽，广泛存在于多种生物体内，是多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中的基本成分，此外，RGD是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位，能够和细胞表面整合素受体特异性结合，在生理和病理过程中发挥重要作用。PUMA/Bbc3是Bcl-2家族BH3-only亚家族成员，在p53依赖性和p53非依赖性细胞凋亡中都起到重要作用，PUMA/Bbc3、Bcl-2/Bcl-xL、Bax/Bak之间的相互作用，线粒体膜通透性的改变，促凋亡分子的释放及Caspase级联效应是PUMA/Bbc3凋亡效应的分子基础。人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子是一个广泛的肿瘤特异性启动子，用hTERT启动子替换腺病毒原始启动子E1A从而使外源基因的表达限制在肿瘤细胞中，提高肿瘤基因治疗的靶向性，以hTERT为特异性启动子的溶瘤腺病毒能特异的识别肿瘤细胞。优选地，上述技术方案中，所述腺病毒质粒为腺病毒质粒AdEAsy-1。优选地，上述技术方案中，所述编码RGD肽的基因插入在腺病毒质粒的纤维基因中，优选的，所述编码RGD肽的基因插在腺病毒质粒纤维基因中HIloop的456T与457P之间，进一步优选的，所述编码RGD肽的基因为编码RGD-4C肽的基因。优选地，上述技术方案中，所述第一穿梭质粒为pShuttle-CMV。优选地，上述技术方案中，所述第一穿梭质粒采用由CMVp连接促凋亡基因PUMA的CDS区，再连接shRNA抗ALDH1A1的基因序列，优选的，促凋亡基因PUMA为PUMA-Alpha基因，在NCBI上的登记号为NM_014417。上述PUMA-Alpha基因(NM_014417)的CDS区(编码序列)连接到靶向人ALDH1A1mRNA的shRNA相关序列(即，shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列)，该shRNA相关序列包括pGIPZ-shRNA载体(DharmaconTM,Cat.RHS4430-200287229)Puro基因CDS区下游(终止密码子后)至WPRE上游(MluI位点)的所有序列，实际包括了miR-30的骨架、shRNA、barcode序列，将这部分序列克隆穿梭质粒pShuttle-CMV的KpnI位点。优选地，上述技术方案中，将包含人端粒逆转录酶启动子的溶瘤原件TERTp-E1A-E1B55K自质粒pTE-D19K中切下，连接在第二穿梭质粒pA信号序列的下游，从而用人端粒酶启动子控制腺病毒E1A基因表达，同时由E1B启动子控制表达腺病毒E1B55K基因；为了进一步提高溶瘤效率，删除E1B19K基因；并将此穿梭质粒与腺病毒骨架质粒AdEasy-1在细菌内同源重组产生重组溶瘤腺病毒质粒/载体而得到。上述质粒pTE-D19K、穿梭质粒pShuttle-CMV、腺病毒质粒AdEAsy-1、大肠杆菌BJ5183感受态为中国疾病控制中心病毒病预防控制所洪涛院士实验室保存。本专利技术还提供了上述重组溶瘤腺病毒载体的构建方法所构建出的重组溶瘤腺病毒载体，所述重组溶瘤腺病毒载体同时携带人端粒逆转录酶启动子、shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列、促凋亡基因PUMA的基因序列和编码RGD肽的基因序列，其中所述人端粒逆转录酶启动子的基因序列如SEQIDNO.1所示，所述shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列如SEQIDNO.2所示，所述促凋亡基因PUMA的基因序列如SEQIDNO.3所示，所述编码RGD肽的基因序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种重组溶瘤腺病毒，由上述重组溶瘤腺病毒载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得；优选的，所述病毒包装细胞为人胚肾293细胞。优选地，上述技术方案中，所述重组溶瘤腺病毒以肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞为双重靶向性。本专利技术还提供了上述重组溶瘤腺病毒载体或上述重组溶瘤腺病毒在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首次将抗肿瘤干细胞标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒；将shRNA抗肿瘤干细胞标志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列连接至第一穿梭质粒，构成第二穿梭质粒；将人端粒逆转录酶启动子连接至第二穿梭质粒，构成第三穿梭质粒；将第三穿梭质粒与靶向性骨架质粒在大肠杆菌中重组为重组溶瘤腺病毒载体。2.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述腺病毒质粒为腺病毒质粒AdEAsy-1。3.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述编码RGD肽的基因插入在腺病毒质粒的纤维基因中，优选的，所述编码RGD肽的基因插在腺病毒质粒纤维基因中HIloop的456T与457P之间，进一步优选的，所述编码RGD肽的基因为编码RGD-4C肽的基因。4.根据权利要求1所述的重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述第一穿梭质粒为pShuttle-CMV。5.根据权利要求4所述的重组溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述第一穿梭质粒采用由CMVp连接促凋亡基因PUMA的CDS区，再连接shRNA抗ALDH1A1的基因序列，优选的，促凋亡基因PUMA为PUMA-Alpha基因，在NCBI上的登记号为NM_0...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟二红，
申请(专利权)人：北京多赢时代转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11