一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法技术

本发明专利技术提供了一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。该方法利用腺病毒穿梭载体 pKO‑FH、pAD‑EF1a‑GFP，经一系列中间过程，得到重组腺病毒表达质粒pAD‑EP153R。将最后得到的线性化重组腺病毒载体质粒转染 HEK293 细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，最终实现腺病毒包装过程，并通过扩增、浓缩和鉴定得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了EP153R基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究基于表达EP153R的腺病毒载体疫苗奠定基础。

A recombinant adenovirus vector expressing the EP153R gene of African classical swine fever virus, its construction method and preparation method of recombinant adenovirus

The invention provides a recombinant adenovirus vector expressing the EP153R gene of African classical swine fever virus, a construction method and a preparation method of the recombinant adenovirus, belonging to the field of genetic engineering technology. The recombinant adenovirus expression plasmid pAD_EP153R was obtained by a series of intermediate processes using adenovirus shuttle vectors pKO_FH and pAD_EF1a_GFP. The recombinant adenovirus vector plasmid was transfected into HEK293 cells. The recombinant adenovirus was screened according to the cytopathic changes caused by adenovirus infection. The recombinant adenovirus which could directly infect eukaryotic cells was obtained by amplification, concentration and identification. The aim of normal expression in eukaryotic cells is to lay a foundation for the study of adenovirus vector vaccine based on EP153R expression.

【技术实现步骤摘要】
一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及EP153R基因过表达腺病毒载体及其构建方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性出血热、高度接触传染性疾病，其临床症状和病理变化表现为高热、皮肤充血、水肿及脏器广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能的改变，致死率高达100％。2007年6月，ASF在格鲁吉亚高加索地区得到确认，并已蔓延至邻国。自2009年以来，本病经格鲁吉亚等国传播到与我国接壤的俄罗斯部分地区并多次爆发，目前已对我国养猪业的持续发展构成巨大威胁。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报类动物疫病，该病已受到世界各国的高度重视，我国已将此病规定为一类动物疾病。ASFV为非洲猪瘟病毒科唯一已知的代表种，是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒；其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小为170-190kb，整个基因组含有150个开放阅读框，可以编码150-200种蛋白，已从ASFV感染细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽。ASFV的P30蛋白是一种很重要的结构蛋白，由EP153R基因编码。研究发现P30能够诱导宿主细胞产生抑制细胞内化的中和抗体，从而使得疾病发作延迟甚至保护细胞抵抗病毒感染，因此P30在阻断病毒与细胞相互作用中有着重要的作用。P30作为病毒的早期蛋白，感染细胞后主要分布于细胞质中，在感染后4小时即可在胞浆内检测到；P30也是最具有抗原性的ASFV蛋白之一，有很强的免疫原性，在感染动物体内能诱导机体产生病毒中和抗体，因此通常被用做诊断抗原。此外，P30蛋白和P54蛋白与易感细胞上的两个不同的受体或结合位点相互作用，能缓和病程。因此，开发基于P30的抗ASFV的候选疫苗，对于防止ASF具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，以制备过表达EP153R基因的重组腺病毒，用于研究ASFV候选疫苗。腺病毒是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。并且具有病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。因此，利用腺病毒进行表达EP153R基因重组腺病毒载体的构建及重组腺病毒的包装，对研究基于表达非洲猪瘟p72蛋白的候选疫苗具有重要意义。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP腺病毒载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒EP153R基因。EP153R基因的序列如SEQNo.1所示。所述多克隆位点为AsisI和MluI的酶切位点。一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：1)将EP153R序列在基因合成公司合成，该序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ；2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列EP153R和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到EP153R基因片段和pKO线性化载体片段；将得到的EP153R基因片段和pKO载体片段进行连接，得到pKO-EP153R；3)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤2)得到的pKO-EP153R和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化EP153R基因片段和腺病毒pAD载体片段；4)将所述步骤3)得到的线性化EP153R基因片段和腺病毒pAD载体片段进行连接，得到pAD-EP153R，使用CMV-F与FH-R进行测序；5)将所述步骤4)得到的质粒pAD-EP153R用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒进行后续实验。优选的，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下表1：表1双酶切体系EP153R基因片段或pKO-FH载体20uL10×Buffer3μLAsisⅠ1μLMLuⅠ1μLddH2O5μL总计30μL所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。优选的，所述步骤2)中连接体系如下表2：表2连接体系目的基因EP153R片段2～6μLpKO载体片段2～4μL10×T4Buffer1μLT4DNA连接酶(10U/μL)1μL总计10μL所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。优选的，所述步骤2)中连接后还包括：对所述连接得到重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。优选的，所述步骤3)中双酶切的反应体系如下表3：表3双酶切反应体系所述双酶切的酶切程序如下表4：表4双酶切反应程序体积50ul37℃2.5h65℃20min4℃保持优选的，所述步骤4)中连接体系如下表5：表5连接体系目的基因EP153R片段2～6μL腺病毒pAD载体片段2～4μL10×T4Buffer1μLT4DNA连接酶(10U/μL)1μL总计10μL所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。优选的，所述步骤5)中单酶切的酶切反应体系如下表6：表6单酶切反应体系所述单酶切程序为37℃，3hr；95℃，5min。表达EP153R基因的重组腺病毒的方法由以下步骤制备得到：Ⅰ.将pAD-EP153R重组质粒使用PEI转染试剂转染HEK293细胞。Ⅱ.将出现CPE的细胞连同培养基吹下，扩大培养，培养3天后收毒。本专利技术提供了表达非洲猪瘟病毒EP153R基因的重组腺病毒的制备方法，具体由以下步骤制备得到：a)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μLDMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上。将前述步骤5)中得到的重组阳性质粒与250μLDMEM培养基制成混合液Mix2。将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟。b)在细胞板上铺满细胞数0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞。c)将步骤a)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于CO2培养箱培养2-3天。d)收集具有CPE效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中，离心后收集上清和细胞沉淀，上清过滤得到过表达EP153R基因的重组腺病毒。本专利技术提供了含有EP153R基因的腺病毒扩增与收毒、纯化与浓缩以及滴度检测、特异性检测。步骤4)具体为：收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用A195回溶得到回溶液；EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存或-80℃保存；病毒的预处理：A)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用A195将病毒沉淀重悬，收集到管中；B)细胞沉淀处理：细胞沉淀用A195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体，其特征在于，包括pAD‑EF1α‑GFP腺病毒载体、插入pAD‑EF1α‑GFP腺病毒载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒EP153R基因；所述EP153R基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体，其特征在于，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP腺病毒载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒EP153R基因；所述EP153R基因具有SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体，其特征在于，所述多克隆位点为AsisI和MluI的酶切位点。3.权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)人工合成非洲猪瘟病毒EP153R基因序列，该基因序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ；2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因序列EP153R和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到线性化EP153R基因片段和pKO-FH载体片段；将得到的线性化EP153R基因片段和pKO-FH载体片段进行连接，得到pKO-EP153R；3)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤2)得到的pKO-EP153R和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化EP153R基因片段和pAD-EF1α-GFP载体片段；4)将所述步骤3)得到的线性化EP153R基因片段和pAD-EF1α-GFP载体片段进行连接，得到pAD-EP153R，测序；5)将所述步骤4)得到的质粒pAD-EP153R用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒用于后续实验。4.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中连接后还包括如下步骤：对所述连接得到的重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。5.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下：所述双酶切反应的温度为37℃，所述双酶切反应的时间为1小时；所述步骤2)中连接体系如下：连接反应的温度为22℃，连接反应的时间为2小时。6.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中双酶切反应的反应体系如下：所述双酶切反应的酶切程序如下：37℃2.5小时65℃20分钟。7.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中连接体系如下：所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。8.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中单酶切的酶切反应体系如下：单酶切反应程序如下：37℃3小时95℃5分钟。9.一种表达非洲猪瘟病毒EP153R基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，由以下步骤制备得到：a)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μLDMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张泉，谢灵志，钱淼，王涛，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32