一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法技术

本发明专利技术提供了一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供一种表达E183L基因重组腺病毒质粒pAD‑E183L，以pAD‑EF1α‑GFP腺病毒表达载体为基础，在多克隆位点处引入E183L基因。本发明专利技术还提供了表达E183L基因的重组腺病毒的制备方法，利用构建得到的pAD‑E183L质粒与腺病毒包装体系PEI混合，实现腺病毒包装过程，得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了E183L基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究表达E183L基因重组腺病毒载体候选疫苗奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法。
技术介绍
非洲猪瘟(AfricanSwineFever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被OIE列为A类疫病。尽管我国尚无该病的传入，却时刻面临传入的风险。因此，对该病开展储备性研究，对于该病的防范具有重要意义。ASFV为正20面体，直径约175nm～215nm。由外包膜、病毒衣壳、内包膜、核壳、病毒核酸5个组成部分。病毒核酸为双链DNA，长度为170kb～190kb。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白有54种。P54蛋白是ASFV的Ⅰ型跨膜结构蛋白，由E183L基因编码，在病毒的复制过程中起重要作用，参与该病毒对细胞的吸附和侵入，能引起宿主细胞凋亡，在病毒变形和感染早期起重要作用。P54蛋白可生成二硫键，在ASFV转染细胞时，形成包膜前体，通过靶向定位内质网膜进行蛋白表达，损伤细胞，P54抗体可中和P54蛋白，部分阻断ASFV的侵入，减轻宿主细胞的损伤。迄今为止，国际上尚未有任何可预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，现有技术中，缺乏对非洲猪瘟防疫的疫苗或其它防范措施的研究。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，以制备过表达E183L基因的重组腺病毒，用于研究ASFV候选疫苗。腺病毒(Adenovirus)是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。并且具有病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。因此，利用腺病毒进行表达E183L基因重组腺病毒载体的构建及重组腺病毒的包装，对研究基于表达非洲猪瘟P54蛋白的候选疫苗具有重要意义。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP载体的非洲猪瘟病毒E183L基因。E183L基因的序列如SEQNo.1所示。一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：1)将E183L序列在基因合成公司合成，该序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ。2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列E183L和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到E183L基因片段和pKO线性化载体片段。3)将所述步骤2)得到的E183L基因片段和pKO载体片段进行连接，得到pKO-E183L。4)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤3)得到的连接产物pKO-E183L和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和腺病毒pAD载体片段。5)将所述步骤4)得到的线性化E183L基因片段和腺病毒pAD载体片段进行连接，得到pAD-E183L，使用CMV-F与FH-R进行测序。6)将所述步骤5)得到的质粒pAD-E183L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒进行后续实验。优选的，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下表1：表1步骤2)的双酶切体系E183L基因片段或pKO-FH载体20uL10×Buffer3μLAsisⅠ1μLMLuⅠ1μLddH2O5μL总计30μL所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。优选的，所述步骤3)中连接体系如下表2：表2步骤3)的连接体系目的基因E183L片段2～6μLpKO载体片段2～4μL10×T4Buffer1μLT4DNA连接酶(10U/μL)1μL总计10μL所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。优选的，所述步骤3)中连接后还包括：对所述连接得到重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。优选的，所述步骤4)中双酶切的反应体系如下表3：表3步骤4)的双酶切反应体系PI-SCE1uLI-CEU1uL10×buffer5uLKO-E183L或腺病毒AD-EF1α-GFP载体20uLBSA0.5uLddH2O22.5uL总计50uL所述双酶切的酶切程序如下表4：表4步骤4)的双酶切反应程序37℃2.5小时65℃20分钟优选的，所述步骤5)中连接体系如下表5：表5步骤5)的连接体系目的基因E183L片段2～6μL腺病毒pAD载体片段2～4μL10×T4Buffer1μLT4DNA连接酶(10U/μL)1μL总计10μL所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。优选的，所述步骤6)中单酶切的酶切反应体系如下表6：表6步骤6)的单酶切反应体系重组质粒pAD-E183L20μL10×Buffer5μLddH2O24.5μLPacⅠ0.5μL总计50μL所述单酶切程序如下表7：表7步骤6)的单酶切程序37℃3小时95℃5分钟本专利技术提供了表达非洲猪瘟病毒E183L基因的重组腺病毒的制备方法，由以下步骤制备得到：1)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μLDMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上。将前述步骤6)中得到的重组阳性质粒与250μLDMEM培养基制成混合液Mix2。将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟。2)在细胞板上铺满细胞数约0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞。3)将步骤1)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于CO2培养箱培养2-3天。4)收集具有CPE效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中，离心后收集上清和细胞沉淀，过滤上清得到过表达E183L基因的重组腺病毒。步骤4)具体为：收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用A195回溶，得到回溶液；EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存；病毒的预处理：a)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用A195将病毒沉淀重悬，收集到管中；b)细胞沉淀处理：细胞沉淀用A195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和细胞沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用A195重悬后加入5mol/LNaCl至终浓度为1moL/L；c)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s，至液体不粘稠；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min；离心后，与病毒上清和细胞沉淀处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体，其特征在于，包括pAD‑EF1α‑GFP腺病毒载体、插入pAD‑EF1α‑GFP腺病毒载体的非洲猪瘟病毒E183L基因；所述E183L基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体，其特征在于，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、插入pAD-EF1α-GFP腺病毒载体的非洲猪瘟病毒E183L基因；所述E183L基因具有SeqIDNo.1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)合成非洲猪瘟病毒E183L基因序列，该基因序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ；2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因序列E183L和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和pKO-FH载体片段；3)将所述步骤2)得到的线性化E183L基因片段和pKO-FH载体片段进行连接，得到pKO-E183L；4)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤3)得到的连接产物pKO-E183L和pAD-EF1α-GFP载体进行双酶切，分别得到线性化E183L基因片段和腺病毒pAD-EF1α-GFP载体片段；5)将所述步骤4)得到的线性化E183L基因片段和pAD-EF1α-GFP载体片段进行连接，得到pAD-E183L，测序；6)将所述步骤5)得到的质粒pAD-E183L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒用于后续实验。3.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接后还包括如下步骤：对所述连接得到的重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。4.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下：所述双酶切反应的温度为37℃，所述双酶切反应的时间为1小时。5.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中连接体系如下：连接反应的温度为22℃，连接反应的时间为2小时。6.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中双酶切反应的反应体系如下：所述双酶切反应的酶切程序如下：37℃2.5小时65℃20分钟7.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中连接体系如下：所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。8.根据权利要求2所述的一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤6)中单酶切的酶切反应体系如下：单酶切反应程序如下：37℃3小时95℃5分钟9.一种表达非洲猪瘟病毒E183L基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，由以下步骤制备得到：1)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μLDMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上；将权利要求2所述的重组阳性质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张泉，曹舒扬，钱淼，王涛，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32