一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因复制缺陷型重组腺病毒的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎(TGE)S基因重组腺病毒的制备方法，本发明专利技术对传统的复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA进行改造，使其能够瞬时表达两个独立的基因，然后将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的纤突蛋白的优势抗原A、D位点的DNA序列与结核分枝杆菌Ag85A基因插入到改造后的穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA‑IRES，获得重组质粒pacAd5 CMV K‑N pA sAD‑IRES‑Ag85A，该重组质粒与复制缺陷型腺病毒骨架DNA pacAd 59.2‑100线性化后，共同转染AD‑293细胞，通过同源重组包装产生复制缺陷型重组腺病毒rAd‑sAD‑IRES‑Ag85A，进一步经纯化、扩增、分装等步骤得到免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。

A method for preparation of immunogenic enhanced * S replication defective recombinant adenovirus of transmissible gastroenteritis

【技术实现步骤摘要】
一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因复制缺陷型重组腺病毒的制备方法
本专利技术涉及生物疫苗
，具体涉及一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因复制缺陷型重组腺病毒的制备方法。
技术介绍
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)引起的一种急性、高度传染性疾病。不同品种和年龄的猪均易感染此病，能够引起各个年龄的猪呕吐、水样腹泻、脱水等，7日龄以内的猪病死率高达100％，成年猪病死率随着年龄的增长病死率逐渐下降。但是，育成猪、育肥猪、母猪等感染该病后会出现厌食、腹泻等症状，严重制约了养猪业的发展。上世纪50年代末，在我国广州、汕头等地的猪场开始出现关于该病的相关报道，随后在华东、东北等地相继分离到猪传染性胃肠炎病毒。通过对我国猪传染性胃肠炎病的流行状况调查发现，该病在每年12月至次年4月感染发病率较高。近年来，猪传染性胃肠炎在我国的流行形式日趋严峻，经常与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻病、致病性大肠杆菌等病原混合感染，严重影响了我国养猪业的发展。目前，针对猪传染性胃肠炎病的防控主要以疫苗接种为主，使用较多的是组织灭活苗或者弱毒苗。尽管灭活苗能够刺激机体产生中和抗体，但是该病毒主要以肠道感染为主。因此，在抗TGEV感染免疫过程中，除体液免疫和细胞免疫外，局部黏膜免疫系统更发挥了重要作用。现在，国内外已经研发出多种针对TGEV的弱毒疫苗，免疫后刺激机体产生抗体所需时间短，但是抗体维持时间也短，需要通过多次加强免疫提高效果。此外，弱毒苗存在易返祖、潜在感染等缺陷。因此，迫切需要开发一种安全、价格便宜、还能有效诱导黏膜免疫的新型疫苗来控制该病的发生与流行。TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，其基因组全长为28-30kb的单股正链RNA，分为7个区，每个区含有一个或多个开放阅读框。TGEV的基因组编码4种结构蛋白(S蛋白、M蛋白、N蛋白和sM蛋白)和4种非结构蛋白，其结构为5’-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-SM-M-N-ORF7-3’。TGEV编码的四种结构蛋白：囊膜蛋白(约28-31KD)，又称M蛋白，是一种N端糖基化的转膜蛋白。M蛋白的羧基端含有一个干扰素基因决定簇，能够在体内介导补体依赖性中和抗体和诱导α-干扰素的合成。小囊膜蛋白(约27.7KD)，又称sM蛋白，在调控病毒粒子装配和释放过程中发挥重要作用。磷蛋白(约47KD)，又称N蛋白，是存在于病毒粒子内部的高度磷酸化的酸性蛋白，在病毒RNA的合成、病毒复制、翻译过程中发挥了重要作用。此外，N蛋白能够激活T淋巴细胞协助S蛋白刺激B淋巴细胞产生针对TGEV的抗体。纤突蛋白(约200KD)，又称S蛋白，位于病毒粒子表面，是主要的免疫原。S蛋白存在3种层次的抗原结构，即抗原位点、抗原亚位点和抗原决定簇。S蛋白具有11个抗原决定簇，其中5个与中和抗体产生相关，包括一个B淋巴细胞抗原决定簇(负责诱导产生病毒中和抗体)。在S蛋白的氨基端有4个抗原位点A、B、C、D，其中A、D位点序列高度保守，是主要诱导机体产生中和抗体的抗原位点，若编码A、D位点的序列缺失，则其表达产物不能诱导机体产生中和抗体。因此，S蛋白一直被作为TGEV基因工程疫苗研发以及诊断技术研究的重要靶蛋白。目前，S蛋白已经被广泛应用于亚单位疫苗、活载体疫苗研究领域。Shoup等利用杆状病毒系统在昆虫体内表达提取TGEVS蛋白作为亚单位疫苗，在给猪进行弱毒苗免疫之后，再用杆状系统表达的S蛋白进行加强免疫，能够显著提高母猪的母源抗体水平，提高对仔猪的保护率，但是单独使用该蛋白作为亚单位苗免疫效果不佳。Smerdo等利用原核表达系统将S蛋白克隆至鼠伤寒沙门氏菌致弱菌株中，该重组疫苗经口服免疫可以刺激机体产生针对TGEV的特异性抗体。Tuboly等利用同源重组的方法将全长的S基因克隆至5型腺病毒载体上，经口服免疫，能够在猪体内检测到针对TGEV和5型腺病毒的特异性抗体，解决机体针对该载体产生的免疫反应是将其进一步推广使用的关键因素。这些基因工程疫苗候选株在一定程度上克服了现有常规疫苗存在的缺陷，但是其免疫原性低，仍然不能达到预期的免疫效果。通过查阅文献发现，Ag85A基因是结核杆菌主要的分泌蛋白，是诱导机体保护性免疫反应的重要靶抗原。Ag85A免疫动物和结核病人可诱导特异性抗体产生和细胞介导的细胞毒性细胞应答反应的出现，诱导白介素2(IL-2)和γ–干扰素(IFN-γ)等细胞因子的分泌。将该基因插入至疫苗候选株中，可以有效提高疫苗的免疫效果。因此，本专利构建了TGEV优势抗原与结核分枝杆菌Ag85A基因共表达的重组腺病毒载体疫苗，弥补了单基因工程疫苗的不足，提高了重组疫苗的免疫原性与免疫反应性。
技术实现思路
本专利技术目的是根据现有技术中存在的上述不足，针对以往根据S蛋白基因功能，选取部分S基因或者完整的S基因，采用不同的表达系统进行研发的基因工程疫苗存在被表达基因转录水平低，或者蛋白结构性质与天然蛋白结构不同等缺陷，研制出一种既能克服上述缺陷，并能诱导机体产生针对TGEV的特异性中和抗体，具有较强的免疫力，以达到有效控制猪传染性胃肠炎病毒的基因工程疫苗。本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术的目的之一是提供一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤：将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列IRES连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES；将含有TGEVS基因的抗原位点DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A基因的抗原DNA序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-sAD-IRES-Ag85A；将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-sAD-IRES-Ag85A和复制缺陷型腺病毒pacAd59.2-100骨架DNA经线性化后，在脂质体的作用下共同转染真核细胞AD-293，得到重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A；将所得到的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A经鉴定、浓缩、纯化、扩增步骤，制备成所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。优选地，提供一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，方法包括如下具体步骤：(1)核糖体结合位点序列IRES的获得：根据GenBank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列ID:gb|EF591488.1，合成脑心肌炎病毒的核糖体结合位点IRES序列，并在IRES序列的两端加入酶切位点EcoRI与BamHI，获得质粒pEx-IRES；(2)穿梭质粒的改造：分别提取质粒pEx-IRES和pacAd5CMVK-NpA，利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES；(3)TGEV优势抗原基因片段的获得：根据GenBank数据库发表的TGEVPurdue115株的S基因序列，设计两对特异性引物(P1、P2、P3、P4)用于分别扩增S基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列IRES连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA‑IRES；将含有TGEV S基因的抗原位点DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A基因的抗原DNA序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA‑IRES上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA‑sAD‑IRES‑Ag85A；将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K‑N pA‑sAD‑IRES‑Ag85A和复制缺陷型腺病毒pacAd5 9.2‑100骨架DNA经线性化后，在脂质体的作用下共同转染真核细胞AD‑293，得到重组腺病毒rAd‑sAD‑IRES‑Ag85A；将所得到的重组腺病毒rAd‑sAD‑IRES‑Ag85A经鉴定、浓缩、纯化、扩增步骤，制备成所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。

【技术特征摘要】
1.一种免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列IRES连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES；将含有TGEVS基因的抗原位点DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A基因的抗原DNA序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-sAD-IRES-Ag85A；将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-sAD-IRES-Ag85A和复制缺陷型腺病毒pacAd59.2-100骨架DNA经线性化后，在脂质体的作用下共同转染真核细胞AD-293，得到重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A；将所得到的重组腺病毒rAd-sAD-IRES-Ag85A经鉴定、浓缩、纯化、扩增步骤，制备成所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒。2.根据权利要求1所述免疫原性增强型猪传染性胃肠炎S基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：(1)核糖体结合位点序列IRES的获得：根据GenBank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列ID:gb|EF591488.1，合成脑心肌炎病毒的核糖体结合位点IRES序列，并在IRES序列的两端加入酶切位点EcoRI与BamHI，获得质粒pEx-IRES；(2)穿梭质粒的改造：分别提取质粒pEx-IRES和pacAd5CMVK-NpA，利用限制性内切酶EcoRI与BamHI分别酶切质粒，经过连接、转化、鉴定后获得改造后的穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES；(3)TGEV优势抗原基因片段的获得：根据GenBank数据库发表的TGEVPurdue115株的S基因序列，设计两对特异性引物(P1、P2、P3、P4)用于分别扩增S基因的A、D抗原表位的序列；收集TGEV细胞培养液，提取TGEVRNA，以OligodT为引物进行反转录获得TGEVcDNA，以TGEVcDNA为模板，以P1、P2、P3、P4为引物，利用PCR技术扩增S基因片段，经琼脂糖凝胶纯化回收后，连接pMD19-T载体，转化，测序，获得含有优势抗原位点的TGEVsAD基因序列pMD19-T-sAD；(4)含有TGEV优势抗原基因穿梭质粒的构建：在步骤(3)中获得pMD19-T-sAD的上下游引物的5’端分别引入限制性内切酶EcoRI、XbaI的酶切位点，通过双酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文晓，牛建蕊，杨鹏，杨丙田，
申请(专利权)人：北京森康生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11