本发明专利技术选择口蹄疫病毒高度保守的3D基因片段作为检测靶基因，设计特异性引物建立FMDV特异性的荧光等温扩增检测方法。本发明专利技术采用Bst DNA聚合酶，具有扩增效率高、特异性好的优点；采用荧光染料指示反应结果，便于准确判定；无需提取样品DNA,简化了检测操作；整个检测过程速度快，只需50min。且本发明专利技术一次可检测多个样品，适于大批样品的检测。所用的荧光恒温扩增仪器成本低；具有扩增效率高、特异性好的优点；可以用于动物血液和组织中的口蹄疫病毒检测。测。
【技术实现步骤摘要】
口蹄疫病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及一种口蹄疫病毒核酸荧光等温扩增检测技术及成套试剂盒，属于微生物检测
技术介绍
[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒 (foot-and-mouth disease virus, FMDV) 引起的, 发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。世界动物卫生组织将口蹄疫列为必须报告的动物烈性传染病, 严重危害畜牧业的发展及相关产品对外贸易。患口蹄疫的动物特征是:会出现发热、跛行和在皮肤与皮肤黏膜上出现水疱等症状。恶性口蹄疫还会导致迅速死亡。
[0003]发病或处于潜伏期的动物是主要的口蹄疫病毒传染源，该病毒可通过空气、分泌物和排泄物，以及被污染的饲料等多种途径传播。对口蹄疫的控制措施包括：强化灭活疫苗免疫接种；加强疫情监测和报告，建立有效的主动检测、预报、预警机制；建立健全应急机制，完善应急预案；严格对移动动物、动物产品的检疫监管。
[0004]口蹄疫病毒检测是开展疫病诊断和检疫的重要依据。病毒感染相关抗原（VIAA）琼脂扩散试验主要用于疫情普查和活畜进出口检疫，仅能对动物是否存在口蹄疫病毒感染抗体进行检测，耗时一天以上。
[0005]当前各级兽医实验室在检测口蹄疫病毒时，主要采用普通RT-PCR方法和荧光RT-PCR方法，但普通RT-PCR检测操作容易造成病毒核酸扩增产物的污染，造成假阳性；而荧光RT-PCR技术则需要价格昂贵的荧光PCR仪，从核酸提取到完成全部检测过程，通常需要2个小时以上。近年来我国对动物及其产品检疫要求开展病原学检测，依据检测结果出具检疫证明，这就需要更快速、简便、准确、低廉并适合在现场应用的FMDV检测技术。
[0006]核酸等温扩增技术是一种新兴的基因检测技术,与广泛应用的普通RT-PCR和荧光RT-PCR相比，具有许多优点。该方法不需要贵重仪器（恒温即可）、操作简单、速度快、灵敏度高，因此得到越来越广泛的应用。但现有的核酸等温扩增方法，主要依靠肉眼观察反应溶液的颜色变化来判定结果，其主观性强、准确性差。
[0007]本专利技术采用荧光剂对双链DNA扩增产物进行染色，用阅读仪检测荧光信号来判定结果，比眼观法提高了准确性；本专利技术采用免提取反应液，处理并释放样品中的病毒RNA，直接进行扩增反应，不必提取样品中的RNA，减少了操作步骤和成本，缩短了检测时间，消除了核酸提取过程中的交叉污染；本专利技术针对口蹄疫病毒基因设计了6条特异性引物，从而保证扩增反应的特异性。
[0008]本专利技术综合运用这些技术，最终建立了新的口蹄疫病毒核酸快速检测方法和试剂盒。本专利技术相比目前广泛使用的PCR和荧光PCR检测方法，具有检测速度快、灵敏度高、操作简便、试剂与设备成本低等优点，适合在动物养殖、屠宰、检疫、监测的现场和基层单位使用，具有良好应用前景。
技术实现思路
[0009]本专利技术的目的是建立免提取核酸的口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法及试剂盒，使检测过程简便易行，结果判读精确，不用借助昂贵仪器，降低检测成本，检测总时间缩短至50分钟，为口蹄疫病毒检测提供快速、灵敏、特异、低成本的技术手段。
[0010]为实现上述专利技术目的，本专利技术综合运用Bst DNA聚合酶等温扩增技术、组织样本核酸免提取技术和荧光指示剂，建立口蹄疫病毒荧光等温扩增检测方法，研制成试剂盒，具体内容如下：1.等温扩增引物设计：参考口蹄疫病毒基因组的核苷酸序列，筛选3D基因保守区域，设计6条引物：FMDF3 ACCCTCGARGCTATCFMDB3 GCGTCACCGCACACFMDFIP TGGACGGCAAGTCCTGTTTTCTCTCCTTTGCACGFMDBIP TACCGGCGTCTCTTTGATTTTCACCCAACGCAGGFMDLF CAACTTCTCCTGTATGGTCCFMDLB TGAGATTCCAAGCTACAGAT2.引物溶液配制：将人工合成引物FMDF3、FMDB3、FMDFIP、FMDBIP用DEPC处理水稀释至20μmol/L，将人工合成引物FMDLF、FMDLB用DEPC处理水稀释至40μmol/L；将稀释后的引物按FMDF3:FMDB3:FMDFIP:FMDBIP:FMDLF:FMDLB=1:1:8:8:2:2的比例混匀。
[0011]3.制备阳性对照：以常规方法克隆口蹄疫病毒3D基因的核苷酸序列，构建pMD20-T-FMDV载体重组质粒，对质粒中的目的基因进行序列测定。测序结果正确后，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将其扩大培养，提取质粒，作为阳性对照。
[0012]4.10
×
等温扩增免提取缓冲液的配制：称取Trisbase：24.23g，KCl：3.73g，(NH4)2SO4：7g，MgSO47H2O：2.465g，Triton X-100：5mL，Brij-58：5g，加DEPC处理水至400mL，盐酸调pH值至8.8（25℃），定容至500mL。高压灭菌冷却后，置于2~8℃保存备用。
[0013]5.荧光等温扩增免提取反应液的制备：取10
×
等温扩增免提取缓冲液2.5 mL、引物液5.5 mL、5 mol/L甜菜碱溶液4 mL、10 mmol/L dNTP Mixture 3.5 mL、100 mmol/L MgSO
4 溶液1.5 mL、0.1%SYBR GreenI液0.5 mL、0.1%DEPC处理水4.5 mL，混匀后（全程无菌低温）用0.45μm滤膜过滤除菌，分装成小管，加贴标签。
[0014]6.Bst DNA聚合酶的制备：Bst DNA聚合酶为外购商品（ NEB 公司），浓度为8U/μL，1000μL/管。将Bst DNA聚合酶无菌定量分装，加贴标签。
[0015]7.矿物油的制备：将液体石蜡油定量分装成小管，加贴标签。
[0016]8.阴性对照的制备：0.1%DEPC水溶液，无菌分装，加贴标签。
[0017]9.检测方法与步骤：（1）在0.2 mL反应管中，每管加入荧光等温扩增免提取反应液22μL和Bst DNA聚合酶1.0μL，再每管加入20μL矿物油。
[0018]（2）加样：每管底部加入1：5稀释的被检测动物血液或组织研磨液2.0μL，同时设置阳性及阴性对照管。盖紧管帽，瞬时离心，放入专用荧光恒温扩增仪或普通荧光PCR仪。
[0019]（3）经过优化的反应参数：采用64℃、50min，每1min采集一次FAM通道荧光信号，共采集50次。当无Tt（Time Threshold）值，且无特征性扩增曲线，判定样品为阴性；当Tt值≤
40.0，且出现典型的扩增曲线，判定样品为阳性；当Tt值＞40.0，且出现典型的扩增曲线，应重做，仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。
[0020]10.本专利技术还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对的组合产品，优选还包括荧光等温扩增免提取反应液（内含SYBR GreenI荧光剂）、Bst DNA 聚合酶、阴本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种快速检测口蹄疫病毒的核酸免提取的荧光等温扩增试剂盒，包括6条特异性引物，其核苷酸序列如下：FMDF3 ACCCTCGARGCTATC;SEQ ID NO.1;FMDB3 GCGTCACCGCACAC;SEQ ID NO.2;FMDFIP TGGACGGCAAGTCCTGTTTTCTCTCCTTTGCACG;SEQ ID NO.3;FMDBIP TACCGGCGTCTCTTTGATTTTCACCCAACGCAGG;SEQ ID NO.4;FMDLF CAACTTCTCCTGTATGGTCC;SEQ ID NO.5;FMDLB TGAGATTCCAAGCTACAGAT;SEQ ID NO.6。2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包荧光等温扩增免提取反应液（内含SYBR GreenI荧光染色剂）、Bst DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照以及矿物油中的一种或多种。3.一种口蹄疫病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒的制备方法，具体包括：（1）引物溶液配制：按权利要求1所述核苷酸序列合成引物，将人工合成引物FMDF3、FMDB3、FMDFIP、FMDBIP用DEPC处理水稀释至20μmol/L，将人工合成引物FMDLF、FMDLB用DEPC处理水稀释至40μmol/L；将稀...
【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ五一IntClC一二Q一七零，
申请(专利权)人：北京森康生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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