本发明专利技术公开了非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术选择目前中国流行的ASFV重要毒力相关因子EP402R基因(CD2v)基因为靶标，构建了阳性质粒标准品并设计了检测非洲猪瘟病毒EP402R基因的实时荧光定量PCR引物和探针，在此基础上，本发明专利技术进一步建立了非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法。本发明专利技术所建立的非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，与已有的经典检测方法符合率高，不仅丰富了ASFV现有检测靶标，在ASFV疫苗毒与野毒的检测上也有重要的应用前景。景。景。
【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法
[0001]本专利技术涉及病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法，尤其涉及非洲猪瘟病毒的检测靶标、荧光定量PCR检测引物以及由此建立的非洲猪瘟病毒EP402R基因TaqMan荧光定量PCR检测方法，属于非洲猪瘟病毒的检测或诊断领域。
技术介绍
[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起猪的一种高度接触性、广泛出血性烈性传染病，死亡率高达100％。19世纪20年代首次在非洲肯尼亚暴发，经过近100年的时间从非洲途经欧洲传至亚洲。2018年8月中国辽宁发生首起ASF疫情，随后迅速蔓延至全国各地，给中国养猪及相关行业造成了无法预估的经济损失。目前，已有10个亚洲国家暴发ASF。由于缺乏安全有效的疫苗，以及全球频繁的贸易往来和人员流动，使得ASF的防控和根除异常艰难。因此，急需研发具有良好保护性和安全性的疫苗来预防该病。荧光定量PCR检测方法对于实验室早期确诊ASF具有十分重要作用。
[0003]ASFV为非洲猪瘟相关病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，也是唯一已知的DNA虫媒病毒，可以通过直接接触受感染的猪及其产品或通过钝缘蜱属软蜱传播。ASFV主要感染肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)和单核细胞(Monocytes)。ASFV基因组为双链闭合线性DNA分子，不同分离株的基因组大小在170-194kb之间变化，含有151
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167个开放阅读框(Open reading frames，ORF)(MAZUR-PANASIUK N,G,NIEMCZUK K.The first complete genomic sequences of African swine fever virus isolated in Poland.Scientific Reports,2019,9(1):4556.)，可编码多种结构蛋白和非结构蛋白。其中CD2v基因(EP402R基因)是ASFV重要的囊膜蛋白，可能在病毒入侵或细胞间传播起作用。CD2v的胞质尾部含有数目可变的富含脯氨酸的重复序列，可与宿主蛋白SH3P7结合。SH3P7与囊泡运输相关，这表明CD2v蛋白可能在调节囊泡运输中发挥作用(Kay-Jackson PC,Goatley LC,Cox L,Miskin JE,Parkhouse RM,Wienands J,Dixon LK.The CD2v protein of African swine fever virus interacts with the actin-binding adaptor protein SH3P7.J Gen Virol.2004,85(1):119-30.)。CD2v也可增强ASFV在软蜱中的复制。研究表明，不同基因型ASFV缺失CD2v后其致弱与免疫保护效果有较大的差异(王涛,孙元,罗玉子,仇华吉.非洲猪瘟防控及疫苗研发:挑战与对策.生物工程学报,2018,34(12):1931-1942.)。国内相关研究也已证实，不同基因型的ASFV缺失CD2v后致弱效果差异较大：ASFV BA71株(基因Ⅰ型)缺失CD2v后可以完全致弱，免疫后具有完全交叉保护效果，然而Malawi LiL-20/1(基因
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型)缺失CD2v未能致弱ASFV，而国内流行毒株(基因Ⅱ型)后免疫猪只存活率为0-50％不等(张艳艳,周鑫韬,齐宇,缪专利技术,王立冬,米立娟,杨金梅,张静远,张守峰,杨金金,王述超,蒋依倩,陈腾,扈荣良.非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究,中国兽医学报,2019,1-5.步志高,陈伟业,赵东明,何希君,刘任强,柳金雄.基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用:
CN110093324A[P].2019-04-26.ARIAS M,DE LA TORRE A,DIXON L,GALLARDO C,JORI F,LADDOMADA A,MARTINS C,PARKHOUSE RM,REVILLA Y,RODRIGUEZ FAJ；SANCHEZ-VIZCAINO.Approaches and perspectives for development of African swine fever virus vaccines.Vaccines(Basel),2017,5(4):35.)因此关于CD2v的功能十分有必要进一步研究。
[0004]ASF对养猪业危害严重，且无安全有效疫苗及治疗药物可用，因此亟需开展综合防控技术及疫苗研发。现阶段，ASF的防控只能依靠加强生物安全措施、早期检测和严格的扑杀。由于ASF的临床症状与多种病毒及细菌性疾病感染极为相似。因此其确诊必须借助实验室检测。针对ASF的检测技术主要有间接免疫荧光试验、红细胞吸附试验、病毒分离、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR等。
[0005]实时荧光定量PCR具有极高的灵敏性和特异性，广泛应用于包括ASFV在内的多种病原检测。目前，ASF的PCR及荧光定量PCR检测主要是针对ASFV B646L(p72)基因，诊断靶标相对单一。
[0006]建立一种针对ASFV的新的检测靶标基因的ASFV荧光定量PCR检测方法对于早期检测防控该病，深入研究ASFV致病机制以及将来疫苗株与野毒感染的鉴别诊断都至关重要。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的之一是提供一种诊断或检测ASFV的新的检测靶标基因；
[0008]本专利技术的目的之二提供用于荧光定量PCR检测ASFV的阳性质粒标准品；
[0009]本专利技术目的之三是提供扩增所述检测靶标基因的PCR引物；
[0010]本专利技术的目的之四是针对ASFV的新的检测靶标基因，建立一种针对新的检测靶标基因的ASFV荧光定量PCR检测方法。
[0011]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0012]本专利技术选择目前中国流行的ASFV重要毒力相关因子EP402R基因(CD2v基因)为靶标，构建了阳性质粒标准品并设计了荧光定量PCR检测引物，最终建立了ASFV MGF360-13L TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。
[0013]本专利技术提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的阳性质粒标准品，包括骨架载体和检测靶标基因，其中，所述的检测靶标基因是非洲猪瘟病毒EP402R基因(CD2v基因)基因；作为一种参考，所述的骨架载体可以是pOK12载体。
[0014]本专利技术还提供了一种扩增非洲猪瘟病毒EP402R基因(CD2v基因)的PCR引物，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。
[0015]本专利技术进一步提供了用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的实时荧光定量PCR试剂盒，包括SEQ ID NO本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒EP402R基因作为检测靶标基因在制备检测或诊断非洲猪瘟病毒试剂中的用途。2.一种用于检测非洲猪瘟病毒的阳性质粒标准品，包括骨架载体和检测靶标基因，其特征在于，所述的检测靶标基因是非洲猪瘟病毒EP402R基因。3.权利要求2所述的阳性质粒标准品在制备检测非洲猪瘟病毒试剂中的应用。4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用包括采用所述的阳性质粒标准品构建检测非洲猪瘟病毒EP402R基因的荧光定量PCR标准曲线。5.一种扩增非洲猪瘟病毒EP402R基因的PCR引物，其特征在于：由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列组成。6.用于检测或诊断非洲猪瘟病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物，其特征在于，包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列组成的定量PCR引物和SEQ ID NO.5所示的探针序列。7.按照权利要求6所述的用于检测或...
【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，孙元，王涛，韩玉，罗玉子，李永锋，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：
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