新型冠状病毒实时荧光RT-RAA引物、探针及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒实时荧光RT

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒实时荧光RT
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RAA引物、探针及检测试剂盒

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[0001]本专利技术属于病毒核酸检测
，具体涉及一种通过实时荧光恒温重组酶扩增方法(RT
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RAA)来快速检测新型冠状病毒的引物、探针以及试剂盒。

技术介绍
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[0002]新型冠状病毒肺炎由新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)感染引起，具有传染性强、人群普遍易感的特点。临床症状以发热、干咳、乏力、呼吸困难为主，严重者并发急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、脓毒症休克、全身炎症反应综合征、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。但部分患者感染SARS
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CoV
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2后未发病，成为无症状SARS
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CoV
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2感染者(无症状感染者)。鉴于病毒较强的传染性和隐蔽性，无症状感染者极可能成为传染源而造成聚集性疫情发生。
[0003]针对SARS
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CoV
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2的检测方法主要以核酸检测、抗体检测为主，又以核酸检测结果阴性作为治疗康复标准，因此样本及选择检测方法至关重要。基于分子生物学的核酸扩增技术是目前唯一能够在症状发作后的最初几个小时内检测感染的方法，具体来说，人体在感染病毒后第3～5d开始对数增加，可达到104～106拷贝/μL。核酸扩增技术的检测阈值为1～10拷贝/μL，因此在此期间可以发现病毒存在，从而能更早地在临床样本中发现病毒。
[0004]已知常用的核酸检测方法主要包括荧光定量PCR(RT
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PCR)、恒温扩增技术两种。RT
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PCR方法对实验室设备和实验人员要求严苛，并且检测耗时长，重组酶恒温扩增技术具有引物设计特异简单，操作方便，扩增迅速，反应温度恒定的优点。重组酶恒温扩增技术包括重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)和重组酶介导恒温扩增技术(Recombinase aided amplification，RAA)两种技术，其不同之处在于RAA是细菌或真菌中获得的重组酶来替代RPA技术中较难获得的噬菌体重组酶，两者整个扩增过程一致，通过结合、链置换、延伸实现体外DNA扩增。RAA是一种不需要热稳定酶和复杂热循环仪，利用单链DNA结合蛋白(single strand DNAbinding protein,SSB)、重组酶和DNA聚合酶，在37～42℃下5～30分钟即可完成核酸扩增的新型等温扩增技术。该技术的原理是先从细菌或者真菌中提取重组酶，在等温的环境下，重组酶与引物紧密结合，形成引物
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酶的聚合体，当带有重组酶的引物在反应体系中搜索到与之完全互补的DNA序列时，在SSB的帮助下，DNA链解旋打开，同时在DNA聚合酶的作用下，扩增形成新的DNA互补链。在恒温条件下，该过程不断重复高效的扩增，最快在反应5分钟时，目的基因的扩增产物即可达到检测水平。扩增产物可与多种检测方法结合进行可视化分析，比如实时荧光定量PCR。
[0005]当前，随着新型冠状病毒常态化检测的趋势，现有技术对人员、场所的限制需要突破，检测用时需要缩短，同时检测设备的便携式和便捷化程度需要提升，以推动诊断前移下移，实现疑似患者的快速诊断和密切接触人群的现场快速筛查，并针对不同需求提供有效的精准快速检测方案。因此，提供一种简便、快速、有效、可用于现场诊断和大规模筛选的新型冠状病毒核酸重组酶恒温扩增检测试剂盒，意义重大。

技术实现思路
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[0006]本专利技术旨在针对新型冠状病毒特异性核酸进行快速准确识别扩增，通过优化恒温扩增体系中的引物探针及各组分的比例，使扩增试剂不仅能灵敏、快速、准确地检测出新冠病毒，并能够在储存和运输过程中保持稳定性、可靠性，实现新型冠状病毒核酸的快速检测分析。
[0007]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供了一种通过实时荧光RT
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RAA方法检测新型冠状病毒的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括针对新型冠状病毒的S基因片段的特异性引物对和探针，其中上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2，探针序列为SEQ ID NO:3。
[0009]本专利技术还提供了上述引物和探针组合在检测新型冠状病毒试剂盒或检测试剂中的应用。
[0010]本专利技术还提供了包含上述的引物和探针组合的试剂盒。
[0011]进一步地，上述试剂盒为新型冠状病毒实时荧光RT
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RAA法检测试剂盒。
[0012]进一步地，所述引物的终浓度分别为420nmol/μL，探针的终浓度为120nmol/μL。
[0013]进一步地，所述试剂盒还包括A Buffer，B Buffer，重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白的冻干酶制剂，阳性对照品和阴性对照品。
[0014]进一步地，所述A Buffer为20％PEG，B Buffer为280mM MgAc。
[0015]与现有技术相比，本专利技术提供了一种实时荧光RT
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RAA方法检测新型冠状病毒的引物、探针、试剂盒，检测快速、灵敏、操作简便。本专利技术采用RAA技术，只需在37～42℃(较佳为42℃)下反应5～20min便可分析结果，不需要复杂的反应程序；且可用于便携式基因扩增设备，适用于野外、现场检测和大规模筛选。本专利技术提供的扩增引物和探针特异性强，灵敏度高，能准确地检测到新型冠状病毒，且检测结果稳定，重复性好；可实现单管现场快速检测新型冠状病毒，全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性。
附图说明：
[0016]图1为不同温度下RAA反应试验结果图，图中1为42℃的扩增曲线，2为41℃的扩增曲线，3为40℃的扩增曲线，4为39℃的扩增曲线，5为38℃的扩增曲线，6为37℃的扩增曲线。
[0017]图2为SARS
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CoV
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2RT
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RAA方法的特异性试验结果图。
[0018]图3为SARS
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CoV
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2RT
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RAA方法的敏感性试验结果图，图中1为1.0
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107拷贝/μL的扩增曲线，2为1.0
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106拷贝/μL的扩增曲线，3为1.0
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105拷贝/μL的扩增曲线，4为1.0
×
104拷贝/μL的扩增曲线，5为1.0
×
103拷贝/μL的扩增曲线，6为1.0
×
102拷贝/μL的扩增曲线，7为1.0
×
101拷贝/μL的扩增曲线。
[0019]图4为SARS
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CoV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过实时荧光RT
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RAA方法检测新型冠状病毒的引物和探针组合，其特征在于：所述引物和探针组合包括针对新型冠状病毒的S基因片段的特异性引物对和探针，其中上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2，探针序列为SEQ ID NO:3。2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测新型冠状病毒试剂盒或检测试剂中的应用。3.一种含有权利要求1所述的引物和探针组合的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为新型冠...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，杨桂文，孙文博，孙晓洁，王华，王嘉琪，薄纯婕，张心如，申传文，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：