本发明专利技术公开了一种鉴定D614G突变位点的特异性crRNA、体系、试剂盒及应用。该特异性crRNA包括如SEQ NO：2、SEQ NO：8、SEQ NO：9、SEQ NO：10、SEQ NO：11、SEQ NO：12、SEQ NO：13、SEQ NO：16、SEQ NO：20、SEQ NO：24、SEQ NO：25和SEQ NO：26所示的任一核苷酸序列。在基于Cas12荧光法基础上构建包含上述特异性crRNA的特异性检测体系和特异性检测试剂盒，应用于新冠病毒D614G突变位点的鉴定、以及野生型与突变型新冠病毒毒株的鉴定，鉴定过程具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。优势。优势。
【技术实现步骤摘要】
鉴定D614G突变位点的特异性crRNA、体系、试剂盒及应用
[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于鉴定新冠病毒 D614G突变位点的特异性crRNA、体系、试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是基因变异的最常见形式，与疾病状态或药物反应密切相关。最近的研究进一步表明，SNPs可以作为疾病诊断和预后的新一代生物标志物。同时，单核苷酸多态性在病毒进化及传播中发挥重要作用，并且对突变毒株的精准检测对疫病防控至关重用。因此，SNP检测对于早期诊断，临床预后和疾病预防非常重要。迫切需要研究人员开发简单、快速和有效的技术，以允许在医疗现场进行敏感和选择性的基因分型和 SNP定量。
[0003]目前，有多种方法可用于单核苷酸多态性基因分型，每种方法都有其优点和局限性。例如，基于核酸测序技术能准确鉴定SNP，但该方法耗时长且需送到专业机构完成，无法在临床一线使用；基于等位基因特异性qPCR技术，虽然可以鉴定部分多位点突变，但对单位点突变检测准确性很低。此外，大多数现有方法灵敏度低或特异性差，有效的SNP鉴别通常需要使用专门的设备，训练有素的人员以及严格的实验条件和精确的温度控制。另外，现有方法所存在的高耗时、高费用和高复杂性使得它们在资源受限的情况下得不到实际应用。因此，急需开发高准确性、快速、简便易用的核酸突变检测技术方案。
[0004]CRISPR
‑
Cas(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA 引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR
‑
Cas12通过引导RNA 指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cas12识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当Cas12蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于上述特性，科学家开发了基于Cas12的快速、准确及灵敏的核酸检测方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种鉴定新冠病毒D614G位点的特异性 crRNA、体系、试剂盒及其检测方法，旨在对新冠病毒D614G位点的突变情况进行快速、准确的检测。
[0006]本专利技术是这样实现的，用于鉴定新冠病毒D614G突变位点的特异性crRNA，该特异性crRNA包括如SEQ ID No：2、SEQ No：8、 SEQ No：9、SEQ No：10、SEQ No：11、SEQ No：12、SEQ No： 13、SEQ No：16、SEQ No：20、SEQ No：24、SEQ No：25和SEQNo：26所示的任一核苷酸序列。
[0007]本专利技术进一步公开了一种基于Cas12荧光法构建的特异性检测体系，该体系包含用于鉴定新冠病毒D614G突变位点的特异性 crRNA，该特异性crRNA包括如SEQ ID No：2、SEQ No：8、SEQ No：9、SEQ No：10、SEQ No：11、SEQ No：12、SEQ No：13、SEQ No： 16、SEQ No：20、SEQ No：24、SEQ No：25和SEQ No：26所示的任一核苷酸序列。
[0008]优选地，该体系包括以下组分：10*Buffer 2μL、40U/μL RnaseInhibitors 1μL、200ng/μL Cas12 protein 1μL、25pmol/μL DNAreporter 1μL、1μM上述crRNA 1μL、Sample XμL、RNA free H2O Upto 20μL。在该体系中，Sample包含新冠病毒D614G位点野生型和突变型基因片段DNA作为模板转录对应的基因RNA样品。
[0009]本专利技术进一步公开了上述特异性检测体系在鉴定新冠病毒 D614G突变位点中的应用。通过上述体系对新冠病毒D614G位点野生型和突变型基因片段DNA作为模板转录对应的基因RNA样品基于Cas12荧光法进行扩增，对扩增产物在特定荧光下进行肉眼观察即可对新冠病毒D614G突变位点进行鉴定。
[0010]相应的，本专利技术进一步公开了一种新冠病毒D614G突变位点的鉴定方法，该方法包括以下步骤：往待检测体系中加入2μL Buffer、 1μL浓度为40U/μL的Rnase Inhibitors、1μL浓度为200ng/μL的 Cas12 protein、1μL浓度为25pM/μL的DNA reporter、5μL Sample、 1μL浓度为1nM/μL权利要求1所述的crRNA和9μL H2O，混合均匀后于37℃反应15min，将反应产物置于在485nm激光灯下，肉眼观察获得结果。
[0011]优选地，该试剂盒包括等温扩增RPA引物对、阳性对照、阴性对照以及权利要求2所述的特异性检测体系。
[0012]优选地，所述等温扩增RPA引物对的序列为：
[0013]F4：5
’‑
TTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGG
‑3’
；
[0014]R4：5
’‑
CCTGTAGAATAAACACGCCAAGTAGGAGTAAGT
‑3’
。
[0015]优选地，所述阳性对照、阴性对照为G614位点DNA片段，所述阴性对照为D614位点DNA片段。
[0016]本专利技术进一步公开了上述特异性检测试剂盒在鉴定野生型与突变型新冠病毒毒株中的应用。
[0017]相应的，本专利技术进一步提供一种野生型与突变型新冠病毒毒株的鉴定方法，该方法包括以下步骤：
[0018](1)取5μL包含D614G位点RNA样品、25μL 2*Buffer、2μL RPA F4引物、2μL RPA R4引物和2.5μL乙酸镁混合均匀，于39℃进行 RT
‑
RPA预扩增30min，获得扩增产物RPA sample；
[0019](2)在Cas12检测体系中，取2μL Buffer、1μL浓度为40U/μL 的Rnase Inhibitors、1μL浓度为200ng/μL的Cas12 protein、1μL浓度为25pM/μL的DNA reporter、5μL Sample、1μL浓度为1nM/μL 权利要求1所述的crRNA和9μL H2O混合均匀，于37℃反应15min，在485nm荧光灯下肉眼观察判定阴阳性结果。
[0020]本专利技术克服现有技术的不足，提供一种鉴定新冠病毒D614G位点的特异性crRNA、体系、试剂盒及其检测方法。本专利技术公开了一系列用于鉴定新冠病毒D614G位点是本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于鉴定新冠病毒D614G突变位点的特异性crRNA，该特异性crRNA包括如SEQ NO：2、SEQ NO：8、SEQ NO：9、SEQ NO：10、SEQ NO：11、SEQ NO：12、SEQ NO：13、SEQ NO：16、SEQ NO：20、SEQ NO：24、SEQ NO：25和SEQ NO：26所示的任一核苷酸序列。2.基于Cas12荧光法构建的特异性检测体系，其特征在于，该体系包含上述权利要求1所述的特异性crRNA。3.如权利要求2所述的特异性检测体系，其特征在于，该体系包括以下组分：10*Buffer 2μL、40U/μL Rnase Inhibitors 1μL、200ng/μL Cas12 protein 1μL、25pmol/μL DNA reporter 1μL、1μM crRNA 1μL、Sample XμL、RNA free H2O Up to 20μL。4.权利要求2或3所述的特异性检测体系在鉴定新冠病毒D614G突变位点中的应用。5.一种新冠病毒D614G突变位点的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：往待检测体系中加入2μL Buffer、1μL浓度为40U/μL的Rnase Inhibitors、1μL浓度为200ng/μL的Cas12 protein、1μL浓度为25pM/μL的DNA reporter、5μL Sample、1μL浓度为1nM/μL权利要求1所述的crRNA和9μL H2O，混合均匀后于37℃反应15min，将反应产物置于在485nm激光灯下，肉眼观察获得结果。6.基于Cas12荧光法构建的特异性检测试剂盒，其特征在于，该试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，王鑫杰，马培翔，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院广州呼吸中心，
类型：发明
国别省市：
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