用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了用于检测猪圆环病毒1型、2型和3型的三重PCR引物试剂盒。利用本发明专利技术提供的三重PCR检测试剂盒可在2小时内对三种病原同时进行检测，所使用的材料价格便宜，所使用的仪器在大多数畜牧场均有配备，并且该方法特异性强，敏感性高，非常适用于临床对猪圆环三种病原的诊断、流行病学调查以及实验室对该三种病原的初步筛查。病原的初步筛查。

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物、检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]对全球养猪业具有重大影响的猪病-猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的病原体就是猪圆环病毒(PCV)。目前报道了三种基因型，分别为猪圆环病毒1型(PCV1)，猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。
[0003]猪圆环病毒(PCV)的全基因组大小一般为2000bp左右，属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子形态为对称的二十面体，不具备囊膜结构。PCV1是首个被发现的PCV病毒，当时被认为是猪肾细胞系传代过程中出现的污染物，但通过观察发现其可以在PK-15细胞系中持续传代但是并不引起细胞病变，1982年通过进一步研究，证明其为一种环状单链DNA病毒，并将其命名为猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)。20世纪90年代早期，在加拿大多个猪场发现爆发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，通过检测发现PCV2是该病的主要病原。在随后的几年，世界各个国家的养猪场均有检出PCV2，并且发现临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)以及猪支原体(Porcine mycoplasmas)等病毒混合感染，给世界各地养猪业造成了巨大的经济损失。2015年，美国科学家在死于急性PNDS的母猪体内首次发现并鉴定出了PCV3。PCV3与其他圆环病毒在结构上非常相似，但衣壳蛋白氨基酸序列具有一定差异，同源性均小于70％。近几年在中国、波兰、韩国、巴西、泰国、德国、丹麦、西班牙和意大利等国均有检出该病毒猪圆环1,2和3型病毒是目前有报道的三种猪圆环病毒，其中猪圆环2和3型常呈现混合感染，并常常与其他病毒混合感染，为临床的诊断和防控带来了极大的难度。
[0004]目前病毒分离和血清学检测通常用于鉴定PCV，但是其检测程序复杂且耗时，限制了它们在临床领域中的应用。近年来，已经开发出直接PCR方法和qPCR方法来检测PCV3。
[0005]但目前已有的检测方法并不适用于临床上区分猪群中共存的PCV1，PCV2和PCV3病毒。在临床上准确对PCV进行检测和区分，对于有效的PCVAD控制非常重要。因此，目前迫切需要一种用于同时鉴别PCV1，PCV2和PCV3的高度特异性，灵敏，方便和快速的诊断分析方法和专用试剂盒。

技术实现思路

[0006]为解决以上问题，本专利技术提供用于检测猪圆环病毒1型，2型和3型的三重PCR引物及试剂盒，该试剂盒能够同时鉴定猪圆环病毒1型，2型和3型，且具有很高的检测灵敏性与特异性。
[0007]为实现上述目的，本专利技术从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面对猪圆环病毒基因组特异序列基因尽心筛选，通过对常见近似病毒的检测筛选，分别选取猪圆环病毒1、2、3型特异性的基因片段作为检测分子，并考虑到扩增片段的长短，以便进行电泳
检测，进而设计特异性引物，同时考虑到多重PCR之间干扰，利用PCR电泳技术对其种间特异性、种内保守性和灵敏度等结果进行检测。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用针对特异DNA分子特异引物，其序列如SEQ ID No1～6所示。
[0008]据此，本专利技术第一方面提供一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物，所述引物为根据猪圆环病毒1型，猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的全基因序列分别设计的引物。
[0009]其中，猪圆环病毒1型的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型的检测引物，由由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒3型的检测引物，由由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成；
[0010]上述的用于检测猪圆环病毒1型，2型和3型的三重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。
[0011]本专利技术第二方面提供一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的检测猪圆环病毒1型，2型和3型的三重PCR引物。
[0012]上述试剂盒还包括10
×
Taq Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。
[0013]上述试剂盒中阳性质控品为：猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒以及猪圆环病毒3型全基因组质粒。
[0014]上述阳性质控品中猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒的构建方法为：设计猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型的特异性引物，通过克隆后连接pMD-18T载体，即得猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒；其中，猪圆环病毒1型特异性引物，由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型特异性引物，由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的反向引物组成。
[0015]本专利技术第三方面提供上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0016]1)从待检样品制备基因组总DNA；
[0017]2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的三重PCR引物，在同一反应体系中进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0018]3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。
[0019]结果判定：
[0020]若待检样品中扩增出目的条带为899bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒1型的核酸，为猪圆环病毒1型检测阳性；
[0021]若待检样品中扩增出目的条带为485bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒2型的核酸，为猪圆环病毒2型检测阳性；
[0022]若待检样品中扩增出目的条带为263bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒3型的核酸，为猪圆环病毒3型检测阳性；
[0023]若待检样品中扩增出目的条带同时包括上述两种或三种，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒1型、2型和3型中相应的两种或三种；
[0024]若待检样品中未扩增出上述目的条带，则为阴性。
[0025]上述试剂盒的使用方法中三重PCR反应体系总体积为50μL，包括：10
×
Taq Buffer，5μL；dNTP，4μL；MgCl2，3μL；ExTaq酶，0.4μL；猪圆环病毒1型的检测引物上下游引物各0.6μL，猪圆环病毒3型的检测引物上下游引物各0.6μL，猪圆环病毒3型的检测引物上下游引物各1.2μL；DNA模板5μL；加入双蒸水至50μL。
[0026]上述试剂盒的使用方法中三重PCR的反应程序包括：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物，其特征在于，其中，猪圆环病毒1型的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型的检测引物，由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒3型的检测引物，由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。2.权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。3.一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物。4.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10
×
Taq Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。5.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中阳性质控品为：猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒以及猪圆环病毒3型全基因组质粒。6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒的构建方法为：设计猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型的特异性引物，通过克隆后连接pMD-18T载体，即得猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒；其中，猪圆环病毒1型特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘爵，郭雨欣，姜海军，侯磊，王菁，韦莉，朱珊珊，全荣，王丹，李子璇，袁枫，宋慧琦，于慧，奚衍洋，吕莫然，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：