一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物及试剂盒，该引物组合物包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：7所示；该引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、以及LB引物或LF引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～6的组合物、包括序列如SEQ ID NO：3、5和8～10的组合物、包括序列如SEQ ID NO：11～15的组合物和包括序列如SEQ ID NO：16～20的组合物的一组或者几组。本发明专利技术基于LAMP技术开发了一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种快速检测新型冠状病毒N501Y 突变的引物组合物及试剂盒。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Coronavirus，CoV)，因其包膜表面有一圈形似日冕的棘突而得名，广泛存在于自然界中，是一种呼吸道病毒，其宿主包括人类、脊椎动物和无脊椎动物。冠状病毒属套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股单链RNA病毒，直径为80～120nm，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知 RNA病毒中最大的。国际病毒分类命名委员会在2012年根据其遗传学差异和血清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ四群，其中β群CoV又进一步分为A、B、 C、D四个组。α、β两群易感染哺乳动物，包含了7种对人类致病的冠状病毒，分别为HCoV
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OC43、HCoV
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229E、SARS
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CoV、HCoV
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NL63、HCoV
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HKU1、 MERS
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CoV和SARS
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CoV
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2；而γ、δ两群则主要感染禽类。冠状病毒是一种常见的、易引发呼吸道疾病的病原体，在引起成人社区获得性肺炎的病毒中，冠状病毒检出率与其他呼吸道病毒的检出率相似。SARS
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CoV
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2感染不仅会对人类的生命安全构成威胁，还会对全球社会经济造成极大损失，我们需要“未雨绸缪”，积极应对，对其流行病学和致病机制进行深入研究，积极研发新型特效药和疫苗，并开发出更有效的检测手段，把冠状病毒扼杀于“摇篮”阶段，为人类的健康保驾护航。
[0003]N501Y突变是出现的新冠病毒刺突蛋白(spike protein，S蛋白)里的一种氨基酸的变异，即病毒S蛋白第501位的氨基酸残基由天冬酰胺变成酪氨酸。 N501Y突变可能会提高病毒与人体细胞表面ACE2受体的亲和力，增强新冠病毒的传染力，病毒更容易入侵细胞，科学家推测英国出现的突变株传染性提高 70％。因此快速检测SARS
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CoV
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2，及时了解病毒株的主流突变情况，对于疫情的防控、疾病的诊疗和疫苗的研发等均具有重要的意义。
[0004]目前逆转录实时PCR技术被认为是SARS
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CoV
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2检测“金标准”，然而该技术操作复杂，扩增速度较慢(2
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3个小时)，需要在要求较高的实验室内才能进行，所需的检测设备价格昂贵，而且需要训练有素的专业技术人员才能进行检测，导致该技术难以推广，尤其是基础设施薄弱、偏远落后的地区难以推广。而环介导等温扩增技术(LAMP)是利用设计的四对特殊引物和具有连置换活性的 Bst DNA聚合酶(具有链置换特性)，在60
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65℃恒温条件下进行特异、高效、快速的扩增靶核酸。但目前未有采用LAMP技术检测新型冠状病毒N501Y突变的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物及试剂盒。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物，包
括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：7所示；
[0008]上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、以及LB引物或 LF引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～6的组合物、包括序列如SEQ ID NO： 3、5和8～10的组合物、包括序列如SEQ ID NO：11～15的组合物和包括序列如 SEQ ID NO：16～20的组合物的一组或者几组。
[0009]进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：2～6的引物和序列如 SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
[0010]进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：3、5和8～10的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
[0011]进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：11～15的引物和序列如 SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
[0012]进一步地，上述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：16～20的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。
[0013]第二方面，本专利技术提供了包括上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒 N501Y突变的扩增体系，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/ 或荧光染料以及去离子水。
[0014]进一步地，在上述扩增体系中，F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L； FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；LB引物和LF引物的终浓度为0.8 μmol/L；PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。
[0015]进一步地，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2
×
反应缓冲液12.5μL， F3引物1μL，B3引物1μL，FIP引物1μL，BIP引物1μL，LF引物或者LB引物1μL，PNA探针1μL，8U酶溶液1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL，模板2μL。
[0016]进一步地，上述扩增体系的反应条件为58℃
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68℃，30
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60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴。
[0017]第二方面，本专利技术提供了包括上述引物组合物的快速检测新型冠状病毒 N501Y突变的试剂盒，其还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
[0018]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0019]本专利技术基于LAMP技术开发了一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30
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60min 内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前景。
附图说明
[0020]图1显示了本专利技术一实施例中检测LAMP检测体系的灵敏度的结果图；从右到左依次为3
×
101copies/ml，3
×
102copies/ml，3
×
103copies/ml，3
×
104copies/ml， 3
×
105copies/ml，3
×
106copies/ml，3
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107copies/ml的阳性模拟样本；
[0021]图2显示了本专利技术一实施例中LAMP检测体系的灵敏度的荧光检测结果图；
[0022]图3显示了本专利技术一实施例中检测LAMP检测体系的特异性的结果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测新型冠状病毒N501Y突变的引物组合物，其特征在于，包括引物组和PNA探针；所述PNA探针的序列如SEQ ID NO：7所示；所述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、以及LB引物或LF引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～6的组合物、包括序列如SEQ ID NO：3、5和8～10的组合物、包括序列如SEQ ID NO：11～15的组合物和包括序列如SEQ ID NO：16～20的组合物的一组或者几组。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：2～6的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：3、5和8～10的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。4.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：11～15的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。5.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括序列如SEQ ID NO：16～20的引物和序列如SEQ ID NO：7所示的PNA探针。6.一种包括如权利要求1
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5任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹国君，邢志芳，许笑，关明，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院北院，
类型：发明
国别省市：