一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒，该引物组合物包括针对P681H突变位点的引物组合物和/或针对Y144del突变位点的引物组合物，针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针和选自包括序列如SEQ ID NO：2～7的组合物、包括序列如SEQID NO：10、14～18的组合物中的一组或者两组引物组；针对Y144del突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：20～24的引物和序列如SEQ ID NO：25的PNA探针。本发明专利技术基于LAMP技术提供了一种快速检测B.1.1.7新型冠状病毒突变株的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在30

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Coronavirus，CoV)，因其包膜表面有一圈形似日冕的棘突而得名，广泛存在于自然界中，是一种呼吸道病毒，其宿主包括人类、脊椎动物和无脊椎动物。冠状病毒属套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，为有包膜的正股单链RNA病毒，直径为80～120nm，约有3万个碱基组成，其遗传物质是已知RNA病毒中最大的。国际病毒分类命名委员会在2012年根据其遗传学差异和血清学特性将冠状病毒分为α、β、γ、δ四群，其中β群CoV又进一步分为A、B、 C、D四个组。α、β两群易感染哺乳动物，包含了7种对人类致病的冠状病毒，分别为HCoV
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OC43、HCoV
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229E、SARS
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CoV、HCoV
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NL63、HCoV
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HKU1、 MERS
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CoV和SARS
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CoV
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2；而γ、δ两群则主要感染禽类。冠状病毒是一种常见的、易引发呼吸道疾病的病原体，在引起成人社区获得性肺炎的病毒中，冠状病毒检出率与其他呼吸道病毒的检出率相似。SARS
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CoV
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2感染不仅会对人类的生命安全构成威胁，还会对全球社会经济造成极大损失，我们需要“未雨绸缪”，积极应对，对其流行病学和致病机制进行深入研究，积极研发新型特效药和疫苗，并开发出更有效的检测手段，把冠状病毒扼杀于“摇篮”阶段，为人类的健康保驾护航。
[0003]由于病毒自身的结构特征及宿主众多，导致该病毒极易发生变异，产生新类型的冠状病毒突变体，例如英国科学家发现了一种被称为B.1.1.7的新冠病毒变种，变异病毒与人受体亲和力提高了1000倍，变异病毒传播能力要比原始毒株高70％左右，而伦敦最近新冠感染病例超过60％都来自变异病毒，“超级传播者”被频繁报道，给疾病的防治带来了极大难度。变异新冠病毒不会增加疾病严重性，但其会导致更高的发病率，产生更多住院及死亡病例，所以需要采取更严格的公共卫生措施来控制这些变异病毒的传播，确保新冠肺炎“可防、可控、可治”，因此快速检测SARS
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CoV
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2，及时了解病毒株的主流突变情况，对于疫情的防控、疾病的诊疗和疫苗的研发等均具有重要的意义。其中，新型冠状病毒S 蛋白上的P681H和Y144del突变与病毒感染宿主细胞的能力密切相关。
[0004]目前逆转录实时PCR技术被认为是SARS
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CoV
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2检测“金标准”，然而该技术操作复杂，扩增速度较慢(2
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3个小时)，需要在要求较高的实验室内才能进行，所需的检测设备价格昂贵，而且需要训练有素的专业技术人员才能进行检测，导致该技术难以推广，尤其是基础设施薄弱、偏远落后的地区难以推广。而环介导等温扩增技术(LAMP)是利用设计的四对特殊引物和具有连置换活性的 Bst DNA聚合酶(具有链置换特性)，在60
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65℃恒温条件下进行特异、高效、快速的扩增靶核酸。本专利技术拟提供了一种试剂盒，采用LAMP的方法，可以同时实现新型冠状病毒S蛋白上P681H和Y144del两个重要突变位点的检测，达到快速鉴别B.1.1.7新型冠状病毒突变株的目的。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物及试剂盒。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物，包括针对P681H突变位点的引物组合物和/或针对Y144del突变位点的引物组合物；该针对P681H突变位点的引物组合物包括引物组和PNA探针；该PNA探针的序列如SEQ ID NO：8所示；
[0008]上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～7的组合物、包括序列如SEQ ID NO：10、 14～18的组合物中的一组或者两组；或
[0009]上述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，包括序列如SEQ ID NO：9～13的引物；
[0010]上述针对Y144del突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：20～24的引物和序列如SEQ ID NO：25的PNA探针。
[0011]进一步地，上述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO： 2～7的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。
[0012]进一步地，上述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO： 9～13的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。
[0013]进一步地，上述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO： 10、14～18的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。
[0014]第二方面，本专利技术提供了包括上述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的扩增体系，其还包括模板、反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
[0015]进一步地，在上述扩增体系中，F3引物和B3引物的终浓度为0.2μmol/L； FIP引物和BIP引物的终浓度为1.6μmol/L；LB引物和LF引物的终浓度为0.8 μmol/L；PNA探针的终浓度为0.8μmol/L。
[0016]进一步地，总体积为25μL的扩增体系包括如下组分：2
×
反应缓冲液12.5μL， F3引物1μL，B3引物1μL，FIP引物1μL，BIP引物1μL，LB引物1μL，LF 引物0或者1μL，PNA探针1μL，8U酶溶液1μL，中性红染料1μL，去离子水2.5μL 或1.5μL，模板2μL。
[0017]进一步地，上述扩增体系的反应条件为58℃
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68℃，30
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60min；所用的设备为普通PCR仪或恒温金属浴。
[0018]第二方面，本专利技术提供了包括上述引物组合物的快速检测突变型新型冠状病毒的试剂盒，其还包括反应缓冲液、酶溶液、中性红染料和/或荧光染料以及去离子水。
[0019]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0020]本专利技术基于LAMP技术提供了一种快速检测B.1.1.7新型冠状病毒突变株的引物组合物及试剂盒，特异性好、灵敏度高，无需复杂、昂贵的辅助设备，在 30
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60min内即可实现核酸分子标志物的快速检测，检测结果可以通过目视法直接判断，具有良好的应用前景。
附图说明
[0021]图1显示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测突变型新型冠状病毒的引物组合物，其特征在于，包括针对P681H突变位点的引物组合物和/或针对Y144del突变位点的引物组合物；所述针对P681H突变位点的引物组合物包括引物组和PNA探针；所述PNA探针的序列如SEQ ID NO：8所示；所述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LB引物和LF引物，选自包括序列如SEQ ID NO：2～7的组合物、包括序列如SEQ ID NO：10、14～18的组合物中的一组或者两组；或所述引物组包括F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物和LB引物，包括序列如SEQ ID NO：9～13的引物；所述针对Y144del突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：20～24的引物和序列如SEQ ID NO：25的PNA探针。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：2～7的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：9～13的引物和序列如SEQ ID NO：8所示的PNA探针。4.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述针对P681H突变位点的引物组合物包括序列如SEQ ID NO：10、14～18的引物和序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢志芳，刘瑞来，蒋浩琴，关明，曹国君，许笑，唐雪梅，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：