一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用技术方案

本发明专利技术公开一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
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Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，尤其是一种基于CRISPR
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Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用。

技术介绍

[0002]病毒感染严重危害人类健康，病毒检测对于疾病的诊断、预防和治疗至关重要，开发有效、准确、快速以及灵敏的检测工具对于疾病控制有着至关重要的作用。尽管在实验室方面检测方法的开发已经取得了巨大的进步，但是仍然需要加强对于非实验室条件下的检测方法开发，尤其要推动现场检测方面(point
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of
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care testing,POCT)需要建立广泛的适用性。基于CRISPR
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Cas的核酸检测技术为开发灵敏快速POCT检测提供了新颖的方式。目前，病毒的检测方法主要包含核酸检测、抗体检测、抗原检测。但是由于抗原检测检出率较低，目前新冠检测主要集中在抗体和核酸检测。其中核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，被认为是检测病毒感染的“金标准”；尽管核酸扩增测试(PCR/RT
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PCR)是目前较早检测病原体的最敏感、最特异的方法，但是由于需要专门的实验室设备和训练有素的技术人员，不适合用于快速的及时诊断。此外，高传染性的病原体则需要实时监测，以便阻止它们在人与人之间的传播。而抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”和“假阴性”的局限性，不适合用于复工复产复学等普通人群筛查，也不适用于在低流行地区的流行病学调查
技术介绍
。
[0003]CRISPR
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Cas(Clustered regularly interspaced palindromic repeat)系统是存在于大部分细菌和古细菌中的获得性免疫系统。成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)以及CRISPR相关(Cas)基因编码构成的RNA介导的免疫系统可以保护细菌和古菌免受病毒和外来DNA的入侵。近年，一些CRISPR
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cas系统，包括Cas13a和Cas12a发现在crRNA(CRISPR RNA)识别靶标序列时具有非特异性的核酸切割活性(也称为反式切割)。这种反式切割活性为高灵敏度、高选择性的核酸检测提供了依据。
[0004]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于CRISPR
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Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种基于CRISPR
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Cas12a系统的可视化病毒检测方法，所述方法通过将病毒基因组RNA逆转录得到cDNA，DNA基因组不需要逆转录过程，再通过PCR扩增获得dsDNA，得到的产物称其为Target DNA，即目标DNA，设计特异靶向病毒基因序列的crRNA，利用Cas12a
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crRNA复合物检测target DNA。
[0008]而且，所述病毒为新型冠状病毒SARS
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CoV
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2。
[0009]而且，具体步骤如下：
[0010]当Cas12a
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crRNA检测到相应的Target DNA时，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加来检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2；此外，利用纳米金聚集颜色改变性质，纳米金颜色的深浅与Target RNA浓度，即新型冠状病毒基因组RNA的浓度具有线性关系，通过智能手机颜色识别器APP从而能够将新冠病毒基因组RNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数转化成具体的数值输出。
[0011]而且，具体步骤如下：
[0012]target DNA存在时能够激发Cas12a
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crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链DNA；在此情况下，若合成一条单链DNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter DNA，即报告DNA，reporter DNA就能被Cas12a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒；而纳米金显色实验中，linker
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ssDNA序列的两端设计为可与纳米金颗粒交联的DNA序列，即DNA1/2
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AuNPs互补配对；后续将Cas12a/crRNA系统与DNA1/2
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AuNPs等体积混合，当linker
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ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2
‑
AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机颜色识别器App灰度分析读取数值；灰度分析得到的数值和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒。
[0013]而且，具体步骤如下：
[0014]通过两步法来检测新型冠状病毒的RNA来得到target DNA，当Cas12a
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crRNA检测到相应的target DNA时，即target DNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与新型冠状病毒浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定新型冠状病毒；此外，当linker
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ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2
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AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机App颜色识别器灰度分析读取数值或者通过Tecan200Pro plate reader测其OD值，测出的数值与新型冠状病毒浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定新型冠状病毒。
[0015]而且，具体步骤如下：
[0016](1)SARS
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CoV
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2质粒构建：合成含有新型冠状病毒N基因片段NC_045512.2的双链DNA，并通过BamHIandEcoR I酶切和T4 DNA连接酶链接构建到PLVX
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AcGFP
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N1慢病毒载体中，以获得SARS
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CoV
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2质粒，构建的质粒命名为lentiSARS
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CoV
‑2‑
N的质粒；
[0017]合成的SARS
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CoV
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2基因片段序列信息(5
’‑3’
)为SEQ ID NO.1：catcgtgttgtctgtactgccgttgccacatagatcatccaaa本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
基因片段序列信息(5
’‑3’
)为SEQ ID NO.1：(2)SARS
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CoV
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2假病毒包装：将构建的含有SARS
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CoV
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2 N基因和ORF1ab基因片段的质粒lentiSARS
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CoV
‑2‑
N与psPAX2和pMD2.G质粒共转染到293T细胞中，转染48小时后，收集细胞培养上清，经过0.45μm滤膜过滤，获得含有SARS
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CoV
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2基因片段的慢病毒，即SARS
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CoV
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2假病毒；(3)SARS
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CoV
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2N片段基因扩增：利用SARS
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CoV
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2特异的引物扩增N片段，扩增引物序列如下：F：SEQ ID NO.2：R：SEQ ID NO.3：(4)将新型冠状病毒质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：马龙，殷利眷，李晓燕，陈思，满淑丽，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：