用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，提供一种用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒，所述的引物、探针由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的探针。所述探针的5

【技术实现步骤摘要】
用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体地，涉及一种用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]诺如病毒(Norovirus，NoV)是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原之一，诺如病毒具有致病率高、感染剂量低、对外界抵抗力强等特点，使得诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童。常见果蔬(草莓、生菜等)和贝类(牡蛎、青口等)已被列为诺如病毒污染的高风险食品。
[0003]诺如病毒归属于嵌杯病毒科(Caliciviridae)诺瓦克样病毒属(Norwalk
‑
likevirus)，该科病毒包括5个属，分别为诺洛病毒、诺瓦克病毒、兔出血病病毒、札如病毒和鼠疫病毒。该病毒为单股正链RNA病毒，无包膜，基因组长度约为7.6kb，在电镜下观察，其结构为小圆形的病毒粒子。是一种单链RNA病毒，无囊膜，直径大约27～32nm。诺如病毒含有40多种不同的病毒株，根据其基因特征，主要分为6个基因型，GⅠ到G
Ⅵ
，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ基因型主要感染人类，而GⅢ和G
Ⅴ
可感染猪、牛和鼠。依据病毒衣壳蛋白(VP1)序列和RNA依赖的RNA聚合酶多态性的配对分布，每个基因型可进一步分为不同的基因亚型，GⅠ有8个基因亚型，GⅡ有至少17个，其中基因型GⅡ，亚型4的诺如病毒(GⅡ.4)，占目前全世界流行的诺如病毒的70％
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80％，主要引发人感染病毒性肠胃炎，GⅡ.4可通过定期的点突变或基因重组积累而产生新毒株，表现出基因/抗原的多样化，几乎是每隔两三年便会出现新的变异株，从而引发大的流行。
[0004]诺如病毒引起人类感染的主要是GI和GII群，感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻，也可见头痛、寒颤和肌肉痛等症状，严重者可出现脱水症状。贝类(牡蛎、青口螺等)已被列为诺如病毒污染的高风险食品。贝类是生长在港湾的双壳软体动物，易受到流入海水的淡水的污染，当人们生食或食用加热不彻底的贝类时，就有可能受到感染。根据国外流行病学调查和实验室验证，许多胃肠炎暴发疫情都与生吃生蚝等贝类食品有关，因此，贝类产品中诺如病毒的检测，对于保障食品安全致关重要。
[0005]目前，诺如病毒的检测方法中实时荧光PCR是公认的最好的广泛应用的检测方法。但是，实时荧光PCR检测有时在样品中仅存在痕量诺如病毒的情况下，往往检测结果不稳定。由于食品中的病毒量往往很低，检测灵敏度的提高至关重要，ddPCR能弥补实时荧光PCR的这些缺陷，进一步提高检测的敏感性和结果稳定性。
[0006]中国专利“201610632652.6、一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法的专利”中，公开了一种精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的试剂盒及检测方法。该技术方案利用微滴式数字PCR技术精确定量检测诺如病毒Ⅰ型的检测方法，该方法无需依赖有证标准物质或其他标准品，具有更高的精确度、灵敏度和重复性，易于标准化。其引物和探针的设计方法为：选取诺如病毒分型基因片段RdRp
‑
VP1，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)设计出10余对引物和探针组合，经过
筛选最终获得特异性强、适用于RT
‑
ddPCR引物/探针组合各1套，其中探针5
’
端标记FAM，3
’
端标记BHQ。
[0007]期刊《农产品质量与安全》、ISSN号：1674
‑
8255，2019年第4期，公开了“贝类中GII型诺如病毒的微滴式数字PCR定量检测方法”的学术论文，其中记载了采用微滴数字PCR(ddPCR)技术，建立RT
‑
ddPCR快速定量检测GⅡ型诺如病毒的方法，该方法中只能够对GⅡ型诺如病毒进行检测，具有一定的局限性。
[0008]期刊《食品安全质量检测学报》、ISSN：2095
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0381，2019年第24期，公开了“双重荧光数字PCR方法定量检测贝类中诺如病毒”的学术论文，其中记载了采用数字RT
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PCR的方法，其引物和探针选自期刊《J Virol Methods》2015,223中的文献
[0009]“Multiplexreal
‑
timeRT
‑
PCRforthesimultaneousdetectionandquantificationofGI,GIIa ndGIVnoroviruses”；由于诺如病毒基因型复杂,而检测引物和探针的选择是参照real
‑
timeRT
‑
PCR的方式，存在简并碱基,因此数字PCR中阳性微滴和阴性微滴之间会有拖尾现象。
[0010]因此，需要提供一种应用ddPCR技术对贝类GⅠ型诺如病毒定量检测方法，实现对贝类中诺如病毒的定量检测、提高检测结果的稳定性，并实现贝类中诺如病毒的绝对定量，以实现对口岸进行进出口食品风险鉴管和预警。

技术实现思路

[0011]有鉴于此，本专利技术提供一种新型的用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针及试剂盒。
[0012]本专利技术的技术方案为；
[0013]一种用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的探针。
[0014]进一步的，所述探针的5
’
端标记HEX，3
’
端标记BHQ1。
[0015]本专利技术中，所述探针为TaqMan探针。
[0016]本专利技术中，所述引物、探针的设计，是本申请专利技术人通过从NCBI查找GI型诺如病毒所有同源序列，根据GI型诺如病毒标准株(NC_001959.2)，的所有同源基因序列，用DNAMAN软件进行同源性比对，选取ORF1和ORF2的连接点设计引物，此区域在病毒序列中高度保守，并以之为模板，用Oligo7软件，设计引物及TaqMan探针，并利用NCBI的BLAST工具筛查其特异性和包容性。
[0017]本专利技术检测GI型诺如病毒的引物及探针设计遵循以下原则：引物与模板要紧密互补，引物相互之间避免形成二聚体或发夹结构，上下游引物的长度一般为18
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25bp之间，且Tm值在58
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60℃之间。确保引物中GC含量在40
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60％。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3
’
端最好不为G或/和C。Taqman探针的长度应在20本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针，其特征在于，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成；其中SEQ ID No.1至SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的引物，SEQ ID No.3所示的核苷酸序列为用于扩增GI型诺如病毒RNA的探针。2.根据权利要求1所述的用于检测水产品GI型诺如病毒的引物、探针，其特征在于，所述探针的5
’
端标记HEX，3
’
端标记BHQ1。3.用于检测水产品GI型诺如病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚丽锋，王小玉，蔡教英，游淑珠，黎财慧，丁琦，符家忍，冯家望，
申请(专利权)人：拱北海关技术中心，
类型：发明
国别省市：