鸽腺病毒B型荧光定量检测引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供特异性的鸽腺病毒B型检测的引物和探针及其试剂盒，所述引物和探针序列如下：引物2条(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)和探针组1条(SEQID NO.3)，本发明专利技术建立的检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于鸽腺病毒B型特异性检测，为后续科学研究鸽腺病毒B型致病机理和开展分子流行病学奠定基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
鸽腺病毒B型荧光定量检测引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术属于动物病毒学领域，具体涉及一种鸽腺病毒B型荧光定量检测引物、探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]人类养鸽历史悠久，鸽经驯化成观赏鸽、赛鸽和肉鸽，拥有较强的免疫系统，加上鸽舍多采用开放式或半开放式，空气流通好，空气新鲜，相比较其他畜禽，鸽生病较少。然而，随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，饲养总量、饲养密度的增加，鸽的饲养方式发生了改变，由于饲养管理水平低，疫病防治意识差，加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比赛)，鸽病也越来越多，越来越严重，越来越复杂。近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽业，据国内外研究，已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、鸽痘、鸽腺病毒感染、H9亚型低致病性禽流感、鸽Ⅰ型疱疹病毒感染、鸽轮状病毒感染和鸽圆环病毒感染等。腺病毒由于种类多，血清型复杂，宿主广泛，或作为主要的致病性病原或作为与其他致病性病原共感染的条件致病性病原，对养鸽业造成严重的威胁。禽腺病毒(Fowl aviadenovirus，FAdV)的血清2型、4型、5型、6型、8型、10型和12型均有在鸽群中检测到，有的血清型会引起鸽出现包涵体肝炎。鸽腺病毒A型(Pigeon aviadenovirus A，PiAdV
‑
A)和鸽腺病毒B型(Pigeon aviadenovirus B，PiAdV
‑
B)是不同于FAdV的腺病毒，虽然同属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，却是不同的病毒种。鸽腺病毒A型主要与幼鸽疾病综合征相关，幼鸽发病后出现呕吐，腹泻，食欲下降，甚至死亡。鸽腺病毒B型可以感染所有日龄的鸽子，其特征是引起鸽子猝死和广泛性肝炎坏死症。也有研究表明在出现呕吐、腹泻的鸽群的粪便中也能检测到鸽腺病毒B型。鸽腺病毒A型基因组大小为45480bp，鸽腺病毒B型的基因组大小为41981bp，两者的核苷酸同源性为54.9％，国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)已经将这两种病毒分类为不同的病毒种。虽然鸽腺病毒B型之前在国外有报道，但国内一直未见报道，近期我们从国内发病的鸽群中也检测到了该病毒的存在。
[0003]实时荧光定量PCR方法(Real
‑
time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测。由于在PCR扩增的指数期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。TaqMan探针法是指Real
‑
time PCR扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5
′
端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、Cy5、JOE等，3
′
端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ
‑
1、BHQ
‑
2等。当探针完整的时候，5
′
端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3
′
端荧光基团淬灭，仪器检测不到5
′
端报告基团所激发的荧光信号。随着Real
‑
time PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5
′‑3′
外切酶活性(此活性是双链特异
性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5
′
端报告基团游离于反应体系中，远离3
′
端荧光淬灭基团的屏蔽，5
′
端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被监测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real
‑
time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，被广泛应用于动物传染病学检测领域。此外，不同荧光报告基团(Reporter，R)标记，可同时对单一样本(尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本)开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种用于鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物和探针及其应用与试剂盒。本专利技术建立的鸽腺病毒B型TaqMan探针实时荧光定量PCR方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测34拷贝/μL，该方法不仅可用于流行病学检测，还可以用于鸽腺病毒B型感染程度的精确定量，可有效用于鸽腺病毒B型致病机制差异研究，本专利技术可填补国内外相关研究领域空白。
[0005]本专利技术的目的通过如下技术方案实现：
[0006]一种用于鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物序列如下：
[0007]引物PiAdV
‑
B
‑
TF(SEQ ID NO.1)：5
’‑
CGTGGATGACACGCTTCTTA
‑3’
；
[0008]引物PiAdV
‑
B
‑
TR(SEQ ID NO.2)：5
’‑
TTCCATTCTCATCCGCAGTTAT
‑3’
；所述探针序列如下：
[0009]探针PiAdV
‑
B
‑
probe(SEQ ID NO.3)：5
’‑
ACTGGGAGTTCACCTCAATACCGA
‑3’
；
[0010]其中，探针PiAdV
‑
B
‑
probe(SEQ ID NO.3)其5
’‑
端标记荧光报告基团FAM，3
’‑
端标记荧光淬灭基团Eclipse。
[0011]所述引物和探针用于鸽腺病毒B型的实时荧光定量PCR检测方法为：
[0012](1)核酸的制备
[0013]用北京全式金生物技术有限公司核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)按照说明书方法进行操作提取鸽腺病毒B型DNA。
[0014](2)阳性标准品的构建：
[0015]利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物PiAdV
‑
B
‑
F：5＇
‑
AACAGTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鸽腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物序列如下：引物PiAdV
‑
B
‑
TF：5
’‑
CGTGGATGACACGCTTCTTA
‑3’
；引物PiAdV
‑
B
‑
TR：5
’‑
TTCCATTCTCATCCGCAGTTAT
‑3’
；所述探针序列如下：探针PiAdV
‑
B
‑
probe：5
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠腾，朱春华，陈珍，刘斌琼，蔡国漳，万春和，黄瑜，江斌，林琳，张世忠，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：