一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法技术方案

本发明专利技术公开了一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，包括以下步骤：步骤S1、获取呼吸系统致病微生物的基因组序列，并依据所述基因组序列获得特异性基因序列和非特异性基因序列；步骤S2、采集真实的呼吸系统致病样本，取所述呼吸系统致病样本的1/2分量引入第一诱变机制获得呼吸系统致病诱变样本，并基于所述呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本构建致病微生物测序文库。本发明专利技术在制作致病微生物测序文库引入变异机制用于模拟微生物变异过程，从而增加了微生物的基因序列丰度，避免变异病毒微生物的测序结果呈“假阴性”，从而提高测序准确度。从而提高测序准确度。从而提高测序准确度。

【技术实现步骤摘要】
一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法


[0001]本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法。

技术介绍

[0002]目标区域靶向捕获后再测序，把目标基因从或基因组区域的DNA片段从全基因组中定向富集后再测序，大大降低了成本，也减轻了后续数据分析的压力。与常规的测序方法相比，靶向捕获后再测序，大大减轻了测序成本和数据分析的成本，同时提高了检测灵敏度。目前广泛应用于人全外显子组的临床检测，在病原微生物应用中比较少有。
[0003]现有技术中RT
‑
PCR方法灵敏度是最高的，新型冠状病毒以及其他呼吸系统致病微生物测序的方法主要依赖RT
‑
PCR确认是疑似病例否为阳性病例，但是在随后的实践中，暴露出该方法漏检率高等弊端，原因主要由于一方面RT
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PCR扩增新型冠状病毒以及其他呼吸系统基因组目的区域都是保守序列，但是新冠病毒是RNA病毒，一旦发生突变和重组，RT
‑
PCR方法获得的靶向捕获探针只能捕获到原始病毒微生物的基因型，而无法捕获到由原始病毒微生物变异而来的基因型，因此会对变异病毒微生物的测序结果呈“假阴性”，从而降低检测准确度，另一方面靶向捕获探针的制备通常仅考虑于基因组的单一性匹配，而忽视了对基因组变异性的考虑，因此难以进行获得更多的序列信息，导致靶向捕获探针的捕获适应性低，通用性差。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，以解决现有技术中无法应对微生物变异序列的捕获，导致靶向捕获测序精度降低，以及靶向捕获探针的捕获适应性低，通用性差的技术问题。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术具体提供下述技术方案：
[0006]一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，包括以下步骤：
[0007]步骤S1、获取呼吸系统致病微生物的基因组序列，并依据所述基因组序列获得特异性基因序列和非特异性基因序列；
[0008]步骤S2、采集真实的呼吸系统致病样本，取所述呼吸系统致病样本的1/2分量引入第一诱变机制获得呼吸系统致病诱变样本，并基于所述呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本构建致病微生物测序文库；
[0009]步骤S3、基于所述呼吸系统致病微生物的基因组序列的特异性基因序列制作第一靶向捕获探针，并对第一靶向捕获探针引入第二变异机制制作第二靶向捕获探针；
[0010]步骤S4、在所述致病微生物测序文库验证第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针的捕获结果，并依据捕获结果保留最佳靶向捕获探针；
[0011]步骤S5、将最佳靶向捕获探针进行量产投入实际使用以捕获呼吸系统致病微生物及呼吸系统致病微生物变异体。
[0012]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤S1，获取呼吸系统致病微生物的基因特异性序列的具体方式为：
[0013]步骤S101、联合重点医院呼吸科和感染科的学术与临床资源，获取呼吸系统致病微生物的种类；
[0014]步骤S102、利用生物信息学依次获取所述呼吸系统致病微生物的所有种类的基因组序列；
[0015]步骤S103、利用序列比对技术对所述基因组序列进行序列选取分别获得非特异性基因序列和特异性基因序列。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤S2，所述呼吸系统致病样本包括咽拭子、痰液、肺部灌洗液、血液中的至少一种。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤S2，所述第一变异机制为所述特异性基因序列变异提供诱变培养的环境，基于所述呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本构建致病微生物测序文库的具体方法包括：
[0018]步骤S201、将1/2分量的所述呼吸系统致病样本诱变培养获得呼吸系统致病诱变样本；
[0019]步骤S202、利用生物信息学获取呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本中的致病样本微生物的基因组序列和变异致病样本微生物的基因组序列；
[0020]步骤S203、依次对致病样本微生物的基因组序列和变异致病样本微生物的基因组序列进行随机打断、末端修复、3
’
端加A、末端加接头、PCR扩增以及磁珠纯化用于去除所述非特异性基因序列以获得仅包含特异性基因序列的第一致病微生物测序基因簇和第二变异致病微生物测序基因簇；
[0021]步骤S204、均匀混合第一致病微生物测序基因簇和第二变异致病微生物测序基因簇获得致病微生物测序文库。
[0022]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤S3，所述第二变异机制为所述特异性基因序列变异提供诱变培养的环境，所述第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针制作的具体方式为：
[0023]步骤S301、对所述呼吸系统致病微生物的基因组序列中的所述特异性基因序列依次进行PCR扩增、磁珠纯化、生物素标记以及双链解离获得第一靶向捕获探针；
[0024]步骤S302、取第一靶向捕获探针1/2分量进行诱变培养获得第二靶向捕获探针。
[0025]作为本专利技术的一种优选方案，所述第一变异机制和第二变异机制相一致，所述诱变培养为将所述呼吸系统致病样本、第一靶向捕获探针放置到诱变场景中产生生物学基因序列的变异。
[0026]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤S4，验证第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针的捕获结果的具体方法包括：
[0027]步骤S401、将所述第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针分别加入致病微生物测序文库进行均匀混合在杂交结合下获得第一靶向捕获文库和第二靶向捕获文库；
[0028]步骤S402、分别对第一靶向捕获文库和第二靶向捕获文库进行reads分布统计、测序覆盖率统计以及测序深度统计生成测序结果。
[0029]作为本专利技术的一种优选方案，所述步骤S4中，依据所述测序结果保留最佳靶向捕
获探针的具体方法包括：
[0030]依次将第一靶向捕获探针文库和第二靶向捕获探针文库的测序深度、测序覆盖率和reads分布分别进行阈值分析：
[0031]若25％<第一靶向捕获探针文库的测序深度<55％且55％<第一靶向捕获探针文库的测序覆盖率<85％且第一靶向捕获探针文库的reads分布<80％，则第一靶向捕获探针文库保留为第一最佳靶向捕获探针文库；
[0032]若25％<第二靶向捕获探针文库的测序深度<55％且55％<第二靶向捕获探针文库的测序覆盖率<85％且第二靶向捕获探针文库的reads分布<80％，则第二靶向捕获探针文库保留为第二最佳靶向捕获探针文库；
[0033]依次第一最佳靶向捕获探针文库和第二最佳靶向捕获探针文库进行双链解离、PCR扩增和磁珠纯化获得第一最佳靶向捕获探针和第二最佳靶向捕获探针；
[0034]将所述第一最佳靶向捕获探针和第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1、获取呼吸系统致病微生物的基因组序列，并依据所述基因组序列获得特异性基因序列和非特异性基因序列；步骤S2、采集真实的呼吸系统致病样本，取所述呼吸系统致病样本的1/2分量引入第一诱变机制获得呼吸系统致病诱变样本，并基于所述呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本构建致病微生物测序文库；步骤S3、基于所述呼吸系统致病微生物的基因组序列的特异性基因序列制作第一靶向捕获探针，并对第一靶向捕获探针引入第二变异机制制作第二靶向捕获探针；步骤S4、在所述致病微生物测序文库验证第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针的捕获结果，并依据捕获结果保留最佳靶向捕获探针；步骤S5、将最佳靶向捕获探针进行量产投入实际使用以捕获呼吸系统致病微生物及呼吸系统致病微生物变异体。2.根据权利要求1所述的一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于：所述步骤S1，获取呼吸系统致病微生物的基因特异性序列的具体方式为：步骤S101、联合重点医院呼吸科和感染科的学术与临床资源，获取呼吸系统致病微生物的种类；步骤S102、利用生物信息学依次获取所述呼吸系统致病微生物的所有种类的基因组序列；步骤S103、利用序列比对技术对所述基因组序列进行序列选取分别获得非特异性基因序列和特异性基因序列。3.根据权利要求2所述的一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于：所述步骤S2，所述呼吸系统致病样本包括咽拭子、痰液、肺部灌洗液、血液中的至少一种。4.根据权利要求3所述的一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于：所述步骤S2，所述第一变异机制为所述特异性基因序列变异提供诱变培养的环境，基于所述呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本构建致病微生物测序文库的具体方法包括：步骤S201、将1/2分量的所述呼吸系统致病样本诱变培养获得呼吸系统致病诱变样本；步骤S202、利用生物信息学获取呼吸系统致病样本和呼吸系统致病诱变样本中的致病样本微生物的基因组序列和变异致病样本微生物的基因组序列；步骤S203、依次对致病样本微生物的基因组序列和变异致病样本微生物的基因组序列进行随机打断、末端修复、3
’
端加A、末端加接头、PCR扩增以及磁珠纯化用于去除所述非特异性基因序列以获得仅包含特异性基因序列的第一致病微生物测序基因簇和第二变异致病微生物测序基因簇；步骤S204、均匀混合第一致病微生物测序基因簇和第二变异致病微生物测序基因簇获得致病微生物测序文库。5.根据权利要求4所述的一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于：所述步骤S3，所述第二变异机制为所述特异性基因序列变异提供诱变培养的环境，所述第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针制作的具体方式为：
步骤S301、对所述呼吸系统致病微生物的基因组序列中的所述特异性基因序列依次进行PCR扩增、磁珠纯化、生物素标记以及双链解离获得第一靶向捕获探针；步骤S302、取第一靶向捕获探针1/2分量进行诱变培养获得第二靶向捕获探针。6.根据权利要求5所述的一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于：所述第一变异机制和第二变异机制相一致，所述诱变培养为将所述呼吸系统致病样本、第一靶向捕获探针放置到诱变场景中产生生物学基因序列的变异。7.根据权利要求6所述的一种呼吸系统致病微生物的靶向捕获测序检测方法，其特征在于，所述步骤S4，验证第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针的捕获结果的具体方法包括：步骤S401、将所述第一靶向捕获探针和第二靶向捕获探针分别加...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨骁，
申请(专利权)人：深圳人体密码基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：