用于检测猪星状病毒的多重RT-PCR引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测猪星状病毒的多重RT

【技术实现步骤摘要】
用于检测猪星状病毒的多重RT
‑
PCR引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及了一种用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]猪星状病毒最早于1980通过电子显微镜在猪粪便中检查发现。星状病毒与多种动物的肠道腹泻疾病相关，从鸟类到哺乳动物，在到人类都有感染。猪星状病毒常常感染年幼的，年老的及免疫力低下的动物。与此同时，在猪星状病毒的阳性样本中经常检查到轮状病毒、冠状病毒、杯状病毒及其他肠道病毒混合感染。猪星状病毒基因型繁多，目前已发现有5个基因型(PAstV1
‑
PAstV5)，各基因型序列同源性不高，表明来源于不同的进化分支。虽然各基因型遗传背景差异显著，不同基因型的猪星状病毒却能够在同一地区，甚至同一头猪体内检出，PAstVs混合感染现象普遍。除此之外，不同基因型PAstV的共感染常常导致基因重组现象，具有跨种间传播甚至人兽共患的潜在风险。PAstV各基因组之间常出现多基因型混合感染的情况，有二种或二种以上的基因型感染，这进一步加速病毒的遗传变异，为猪星状病毒的监控带来挑战。值得一提的是，猪星状病毒种间屏障可能并不严格，遗传进化分析结果提示猪星状病毒可能跨越了人及其他动物的种间屏障。研究者发现，人星状病毒与猪星状病毒部分ORF2基因存在重组现象，表明猪星状病毒在进化过程中与人星状病毒有密切的关系。所以，建立高效快捷的检测方法可以监测猪星状病毒在猪群中的感染情况，分析毒株之间的重组及变异规律，这对星状病毒的生物学特性，致病机理和预防人兽共患星状病毒感染具有重要的公共卫生学意义。
[0003]在当今集约化管理的生产中，猪星状病毒多基因型混合感染的情况普遍发生，，对其流行病学的监测是一项长期的、十分有必要的工作，建立一种快速、准确的诊断方法成为PAstVs监控的有力工具。相比而言，建立多重PCR检测技术能同时扩增多种基因片段，且成本低，快速、价格廉价，无疑是当前最好的检测手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术为解决单RT
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PCR操作繁琐、交叉污染风险高的问题，提供一种操作简便、避免叉污染，节约检测时间、试剂消耗、针对性强和灵敏度高的用于检测猪星状病毒多重RT
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PCR引物组、试剂盒及其应用，具体方案如下：
[0005]用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR引物组，包括五对特异性引物，分别是引物PAstV1
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F和PAstV1
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R、引物PAstV2
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F和PAstV2
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R、引物PAstV3
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F和PAstV3
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R、引物PAstV4
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F和PAstV4
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R、引物PAstV5
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F和PAstV5
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R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。
[0006]用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR试剂盒，所述试剂盒包括多重RT
‑
PCR引物组。
[0007]所述试剂盒还包括5
×
buffer、dNTPMix、M
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MLVReverseTranscriptae、RNA酶抑制剂、RNA、TarakaEx
×
Taq、10
×
ExTaqBuffer、dNTPMix、TemplatecDNA和ddH2O。
[0008]所述的用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR引物组在RT
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PCR扩增中的应用。
[0009]所述RT
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PCR扩增反应体系为多重RT
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PCR引物组各0.8μmol/L、TarakaEx
×
Taq0.25μL、10
×
ExTaqBuffer5μL、dNTPMix4μL、cDNA模板各1μL、灭菌后ddH2O补齐至50μL。
[0010]所述RT
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PCR扩增反应条件为98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。
[0011]本专利技术的优点
[0012]1、针对目前缺乏对多基因型的猪星状病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，专利技术人研究设计了五对特异性引物，分别是引物PAstV1
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F和PAstV1
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R、引物PAstV2
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F和PAstV2
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R、引物PAstV3
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F和PAstV3
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R、引物PAstV4
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F和PAstV4
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R、引物PAstV5
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F和PAstV5
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R，并建立了制备了相应的RT
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PCR试剂盒并建立相应的RT
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PCR检测方法。该RT
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PCR检测方法能对同一份检测样品的总RNA获取的cDNA为模板，进行PCR扩增，根据扩增产物的大小，通过琼脂糖凝胶电泳判断待检测样品感染病毒的基因型，实现在同一个反应体系中同时扩增病毒的五种基因型进行鉴别，对早期检测和有效防控猪星状病毒的发生与蔓延具有重要的实际作用。
[0013]2、本专利技术在实际操作中简便，减少了操作次数，极大的避免了交叉污染，节约检测时间和试剂消耗。由于建立的检测方法针对的病毒保守区基因扩增，针对性强，灵敏度高。在临床实验中能够达到简便、经济、便捷和准确的检验要求。对了解猪星状病毒的流行情况、疾病的预防和控制提供了技术支持。为监测猪星状病毒1～5型的流行及混合感染情况和分子生物学快速诊断奠定了基础。
附图说明
[0014]图1是PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5对应的特异性引物检测图，图中泳道从左到右依次为M：M:DL2000 DNA Marker；A、B、C、D、E依次为PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4、PAstV5；
[0015]图2是多重RT
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PCR引物浓度优化图，其中M:DL2000 DNA Marker；1，2，3，4，5的引物浓度依次为0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L。
[0016]图3是多重RT
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PCR退火温度的优化图，其中M:DL2000 DNA Marker；1，2，3，4，5的退火温度分别为53℃；54℃；55℃；56℃；57℃。
[0017]图4是本专利技术同时检测PAstV1、PAstV2、PAstV3、PAstV4和PAstV5对应的引物特异性检测结果图，图中泳道从左至右依次为：M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR引物组，其特征在于，包括五对特异性引物，分别是引物PAstV1
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F和PAstV1
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R、引物PAstV2
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F和PAstV2
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R、引物PAstV3
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F和PAstV3
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R、引物PAstV4
‑
F和PAstV4
‑
R、引物PAstV5
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F和PAstV5
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R，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10的碱基序列。2.用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的多重RT
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PCR引物组。3.根据权利要求2所述的用于检测猪星状病毒的多重RT
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PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括5
×
buffer、d...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：