检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法。该核酸探针组合包括一组或多组多重特异性引物组合，和/或顺序固定于膜芯片表面的一条或多条探针组合；所述引物组合包括生殖道常见病原体的引物和内源对照GAPDH基因的引物；所述探针组合包括生殖道常见病原体特异性探针、阳性杂交点探针和内源对照GAPDH基因的探针。本发明专利技术采用多重PCR与反向斑点杂交结合技术，解决常规引物和探针对生殖道病原体检测准确率低以及难以实现7种以上生殖道病原体单反应体系平行检测的问题，克服了现有技术多重反应体系容易交叉污染出现假阳性，准确性低的缺陷，具有检测快速、操作方便、准确度和灵敏度高、特异性好、检测结果可视等优点。果可视等优点。果可视等优点。

【技术实现步骤摘要】
检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物诊断检测
更具体地，涉及一种快速检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法；具体涉及人型支原体/奈瑟淋球菌/沙眼衣原体/解脲脲原体/生殖支原体/人巨细胞病毒/单纯疱疹病毒Ⅱ型的鉴定方法、引物、探针和试剂盒。

技术介绍

[0002]生殖道感染(Reproductive Tract Infection，RTI)是妇女的常见病和多发病，是由于受细菌、病毒、支原体、霉菌、滴虫等多种病原体的侵袭而引起女性生殖道感染的一大类传染病的总称，包括阴道炎、外阴炎、盆腔炎等感染。女性生殖道感染是全球性的社会及公共卫生问题，具有发病率高、复发率高、流行范围广的特点。生殖道感染是多种疾病的源头，如果得不到及时诊断和正确治疗，可使艾滋病和宫颈癌的发生风险增加，以及引起不孕症，异位妊娠、流产、死胎、死产、早产、先天感染及新生儿感染、慢性腹痛等并发症，严重影响健康。世界卫生组织发布的数据表明，中国每年至少有2亿女性患生殖道感染及相关疾病。另据统计表明，妇产科门诊患者中，生殖道感染占55％以上。
[0003]生殖道病原体是引起生殖道感染性疾病的主要病因，常见的病原体主要有人型支原体(Mycoplasma hominis,MH)、奈瑟淋球菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium,MG)、人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)、单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex VirusⅡ,HSVⅡ)等。流行病学调查显示，各地病原体检出率均不相同，并且不同年龄段患者容易感染的病原体也不同，另外混合型感染越来越常见，已成为医院妇科、皮肤性病科、泌尿生殖科的常见疾病，为我国重点防治的对象。
[0004]核酸杂交技术根据检测目的和方法的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位(原位)杂交。其中，固相杂交又可分为斑点杂交、印迹转移杂交。这类杂交技术的特点是将酶切产物或PCR扩增片断直接点膜或经电泳后Southern转移固定至膜上，再与液相中标记的特异探针杂交，这种杂交模式称为正向分子杂交。但是，应用该法检测待检样品时，一次反应仅能与一种探针杂交，多用于检测样品中所扩增的靶基因有无；如要对多个基因或多个突变位点同时进行鉴定，则需与多种探针一一杂交反应，繁琐而费时，难以满足检测要求。而反向分子杂交是将一系列包括属、群、种特异的寡核苷酸探针固定于膜或微孔板上，再与液相中待检标记的PCR产物杂交。反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)的技术原理是：预先将特定的寡核苷酸探针排列固定于固相载体上，采集待检标本，提取基因组DNA或RNA，应用生物素修饰的特异引物扩增DNA或反转录扩增RNA，使PCR产物带有生物素标记，将PCR产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法检测和判读杂交结果。1989年Saiki等首次结合PCR扩增并应用反向斑点杂交(RDB)方法，即采用PCR
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反向斑点杂交(PCR
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RDB)技术同时检测全血中β地中海贫血多种基因突变位点，使β地中海贫血基因突变诊断取得了飞跃式进展。由于PCR
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反向斑点杂交技术操作相对简便、快速、且价格相对低廉，因而已经在各种检测中应用于基因分型、基因突变检测和病原微生物菌种鉴
定等领域。
[0005]目前，由于生殖道微生物菌群种类繁多，环境复杂，传统的细菌检测方法特异性不高，且灵敏度较低。现有技术中针对病原体的检测方法主要是微生物培养法、血清学方法、定性PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)法等，均有相应的不足。其中，微生物分离培养鉴定是细菌和病毒检测的金标准，但是整个过程耗时约2～3天甚至更长，且操作繁琐，假阴性率高，培养结果易受外界环境影响；血清学方法用于检测血清中的抗体，适用于潜伏期、无症状病人及流行病学调查，包括型特异性血清抗体检测、免疫印迹法、ELISA等方法，该方法操作简单，但由于抗体形成较晚，血清学方法敏感性和特异性欠佳；定性PCR用于检测微生物中靶基因序列，一般采用凝胶电泳分析，耗时短，但具有一定的局限性，只能检测到10ng以上的DNA条带，因此在目的片段产量较低时无法检测到，灵敏度较低；而实时荧光定量PCR通过检测荧光信号的强弱从而实时检测PCR产物扩增量，可以对微生物中靶基因进行定量分析，检测结果准确，重复性高，但是只能做单重或最高3～4重，无法提高其通量，并且需要昂贵的专门仪器和专业操作人员，无法大规模推广应用。
[0006]反向斑点杂交技术(RDB)能够并行处理生物样本中的多个信息，因其检测高通量、高灵敏度，操作相对简便、快速、且价格相对低廉已广泛用于多个科研和领域，包括地中海贫血、HPV分型、HBV分型、差异表达基因、病原微生物菌种鉴定等，在病原微生物物种鉴定中具有极大的应用前景。与目前常规的实验室鉴定方法和其它分子鉴定方法相比，反向斑点杂交技术可以一次实验同时对病原微生物的多种基因进行快速基因型别鉴定，具有检测信息量大的特点，实验室常规的病原微生物检测时间可以从目前的3～10天缩短至4小时。另外，与DNA序列测定和最近几年发展的DNA芯片技术相比，反向系列探针杂交技术不需昂贵的仪器设备，试剂价格相对低廉，所以更具有广泛应用的潜力，尤其适合在发展中国家开展使用。该技术对引物和探针的灵敏度和特异性要求很高，合理的引物和探针设置是关键。
[0007]公开号为CN 107630097 A的中国专利文献公开了一种可用于同时检测包括沙眼衣原体、解脲脲原体、微小脲原体、淋球菌、生殖支原体、人型支原体、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型的多重PCR引物组及方法。另外，公开号为CN 107099618 A的中国专利文献公开了一种用于检测泌尿生殖道致病微生物的LAMP引物组合物及其相关应用，将LAMP法的微流控芯片技术应用于性传播泌尿生殖道致病微生物的检测，利用微流控芯片提高生殖道致病微生物的检测速度，能够在1h内获得8种致病微生物指标的检测结果，而且提供的8个引物组对沙眼衣原体DNA、淋球菌DNA、解脲脲原体DNA、人型支原体DNA、生殖支原体DNA、单纯疱疹病毒2型DNA的最低检测限均为5
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102拷贝/μL。这两个专利均是基于LAMP的方法对生殖道病原体核酸进行检测。但是，该方法检测待测样品中靶序列的灵敏度不高，分辨能力较差，容易出现假阳性和假阴性的情况；并且该方法对所检测核酸的质和量要求都比较高。同时，该方法实际只能进行单重反应，一个反应池一次反应只能检测一种基因或病原体，不能特异地对多个靶标基因或病原体进行检测，并非传统意义上将多对引物组合后进行单次扩增的多重PCR。真正的多重PCR需要将多对引物进行组合，多对引物会增加3
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末端引物互补的可能性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测生殖道常见病原体的核酸探针组合，其特征在于，包括：一组或多组多重特异性引物组合，和/或顺序固定于膜芯片表面的一条或多条探针组合；所述引物组合包括生殖道常见病原体的引物和内源对照GAPDH基因的引物；所述探针组合包括生殖道常见病原体特异性探针、阳性杂交点探针和内源对照GAPDH基因的探针；所述生殖道常见病原体包括人型支原体、奈瑟淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、生殖支原体、人巨细胞病毒和单纯疱疹病毒Ⅱ型；其中，人型支原体的正向引物序列如SEQ ID No.1所示、反向引物序列如SEQ ID No.2所示；探针序列如SEQ ID No.3所示；奈瑟淋球菌的正向引物序列如SEQ ID No.4所示、反向引物序列如SEQ ID No.5所示；探针序列如SEQ ID No.6所示；单纯疱疹病毒Ⅱ型的正向引物序列如SEQ ID No.7所示、反向引物序列如SEQ ID No.8所示；探针序列如SEQ ID No.9所示；人巨细胞病毒的正向引物序列如SEQ ID No.10所示、反向引物序列如SEQ ID No.11所示；探针序列如SEQ ID No.12所示；沙眼衣原体的正向引物序列如SEQ ID No.13所示、反向引物序列如SEQ ID No.14所示；探针序列如SEQ ID No.15所示；解脲脲原体的正向引物序列如SEQ ID No.16所示、反向引物序列如SEQ ID No.17所示；探针序列如SEQ ID No.18所示；生殖支原体的正向引物序列如SEQ ID No.19所示、反向引物序列如SEQ ID No.20所示；探针序列如SEQ ID No.21所示；所述内源对照GAPDH基因的正向引物序列如SEQ ID No.22所示、反向引物序列如SEQ ID No.23所示；所述阳性杂交点探针序列如SEQ ID No.24所示；所述内源对照GAPDH基因的探针序列如SEQ ID No.25所示。2.根据权利要求1所述的核酸探针组合，其特征在于，所述探针的5
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端标记有用于固定至基因芯片上的连接基团。3.根据权利要求2所述的核酸探针组合，其特征在于，所述连接基团为氨基。4.根据权利要求1所述的核酸探针组合，其特征在于，各病原体的正向引物或反向引物5
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端带生物素标志。5.权利要求1～4任一所述的核酸探针组合在制备检测生殖道常见病原体的试剂或试剂盒中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄盈，李文静，郎小亮，周航，黄广平，
申请(专利权)人：四川华汉三创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：