一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针及其制备方法技术

本申请公开了一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针及其制备方法，所述引物探针为由以下引物探针组组合获得的多重引物探针组：用于检测细菌内参的引物探针组A，用于检测沙门氏菌的引物探针组B，用于检测大肠O157的引物探针组C，用于检测金黄色葡萄球菌的引物探针组D，用于检测单增李斯特菌的引物探针组E，用于检测轮状病毒的引物探针组F，用于检测诺如病毒GI型的引物探针组G，用于检测诺如病毒GII型的引物探针组H，用于检测病毒外参的引物探针组I。旨在解决现有技术对即食果蔬中的致病微生物筛检效率低的问题。病微生物筛检效率低的问题。病微生物筛检效率低的问题。

A primer probe for detecting pathogenic microorganisms in ready to eat fruits and vegetables and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针及其制备方法


[0001]本申请涉及生物检测
，尤其涉及一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针及其制备方法。

技术介绍

[0002]即食生鲜果蔬食品因为食用方便、口味清新和味道鲜美，更是人们日常生活中和餐桌上常见的食物，但是，生鲜果蔬食品在果蔬的采摘、运输、清洗、加工和消费过程中，致病菌也易因运输车辆、加工和储存器具，以及清洗水源的不洁净或人工操作的不规范而交叉污染。仅经简单清洗，未经高温杀菌处理，其表面和内部附着的微生物，尤其是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌及部分病毒(诺如病毒、轮状病毒)等水果蔬菜中常见的致病微生物因而可能部分残留，给生鲜果蔬食品的食用安全性造成了极大的隐患，而就目前而言，现有的检测技术对即食生鲜果蔬食品中致病微生物的筛检效率低。

技术实现思路

[0003]本申请的主要目的是提供一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针及其制备方法，旨在解决现有的检测技术对即食生鲜果蔬食品中致病微生物的筛检效率低的问题。
[0004]为解决上述技术问题，本申请提出了：一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针，为由以下引物探针组组合获得的多重引物探针组：
[0005]用于检测细菌内参的引物探针组A，所述引物探针组A包括引物A1、引物A2和探针A；其中，引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0006]用于检测沙门氏菌的引物探针组B，所述引物探针组B包括引物B1、引物B2和探针B；其中，引物B1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，引物B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0007]用于检测大肠O157的引物探针组C，所述引物探针组C包括引物C1、引物C2和探针C；其中，引物C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
[0008]用于检测金黄色葡萄球菌的引物探针组D，所述引物探针组D包括引物D1、引物D2和探针D；其中，引物D1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物D2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
[0009]用于检测单增李斯特菌的引物探针组E，所述引物探针组E包括引物E1、引物E2和探针E；其中，引物E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，引物E2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，探针E的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
[0010]用于检测轮状病毒的引物探针组F，所述引物探针组F包括引物F1、引物F2和探针F；其中，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17
所示，探针F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
[0011]用于检测诺如病毒GI型的引物探针组G，所述引物探针组G包括引物G1、引物G2和探针G；其中，引物G1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，引物G2的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，探针G的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
[0012]用于检测诺如病毒GII型的引物探针组H，所述引物探针组H包括引物H1、引物H2和探针H；其中，引物H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，引物H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，探针H的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
[0013]用于检测病毒外参的引物探针组I，所述引物探针组I包括引物I1、引物I2和探针I；其中，引物I1的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，引物I2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，探针I的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
[0014]为解决上述技术问题，本申请还提供了一种如上所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法，包括以下步骤：
[0015]获取目的检测靶标；
[0016]对所述目的检测靶标进行序列分析，获得目的序列组；
[0017]基于所述目的序列组，获得备选引物组；
[0018]根据备选引物的序列组，获得特异杂交探针组；
[0019]将所述备选引物组和所述特异杂交探针组进行优化处理，获得多重引物探针组。
[0020]作为本申请的一些可选实施方式，所述对所述目的检测靶标进行序列分析，获得目的序列的步骤，包括：
[0021]对所述目的检测靶标进行序列分析，获得特异序列片段作为目的序列。
[0022]作为本申请的一些可选实施方式，所述基于所述目的序列，获得备选引物的步骤，包括：
[0023]基于所述目的序列，设计获得第一备选引物；
[0024]采用标准模板对所述第一备选引物进行扩增效率测试，获得第二备选引物；
[0025]将所述第二备选引物以非目的检测靶标为模板进行特异性测试，获得第三备选引物。
[0026]作为本申请的一些可选实施方式，所述PCR扩增的体系组分及比例包括：
[0027]1U/μL的UNG酶0.02μL；
[0028]10mM的dNTPs试剂1.3μL，所述的dNTPs试剂包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP；
[0029]5U/μL的反转录酶、Taq DNA聚合酶混合液0.5μL；
[0030]2倍浓度的PCR缓冲液10μL，所述PCR缓冲液中包含Mg
2+
；
[0031]引物mix；
[0032]核酸模板2
‑
5μL；
[0033]其余为无酶水。
[0034]作为本申请的一些可选实施方式，所述PCR扩增的程序为：
[0035]45℃下反应30min，循环1次；
[0036]95℃下反应2min，循环1次；
[0037]94℃下反应30s、55℃下反应30s和72℃下反应30s，循环35次；
[0038]72℃下反应5min，循环1次；
[0039]4℃下保存。
[0040]作为本申请的一些可选实施方式，所述引物mix由引物探针组中引物进行组合而得。
[0041]作为本申请的一些可选实施方式，所述根据备选引物的序列，获得特异杂交探针的步骤，包括：
[0042]根据备选引物扩增的产物序列，设计获得第一特异探针；
[0043]将所述第一特异探针进行杂交效果测试，获得杂交效果的测试结果；
[0044]基于所述杂交效果的测试结果，选择获得特异杂交探针。
[0045]作为本申请的一些可选实施方式，所述杂交步骤包括：
[0046]杂交：杂交液为2
×
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测即食果蔬中致病微生物的引物探针，其特征在于，为由以下引物探针组组合获得的多重引物探针组：用于检测细菌内参的引物探针组A，所述引物探针组A包括引物A1、引物A2和探针A；其中，引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；用于检测沙门氏菌的引物探针组B，所述引物探针组B包括引物B1、引物B2和探针B；其中，引物B1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，引物B2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用于检测大肠O157的引物探针组C，所述引物探针组C包括引物C1、引物C2和探针C；其中，引物C1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物C2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针C的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；用于检测金黄色葡萄球菌的引物探针组D，所述引物探针组D包括引物D1、引物D2和探针D；其中，引物D1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物D2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针D的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；用于检测单增李斯特菌的引物探针组E，所述引物探针组E包括引物E1、引物E2和探针E；其中，引物E1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，引物E2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，探针E的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；用于检测轮状病毒的引物探针组F，所述引物探针组F包括引物F1、引物F2和探针F；其中，引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；用于检测诺如病毒GI型的引物探针组G，所述引物探针组G包括引物G1、引物G2和探针G；其中，引物G1的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，引物G2的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，探针G的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；用于检测诺如病毒GII型的引物探针组H，所述引物探针组H包括引物H1、引物H2和探针H；其中，引物H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，引物H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，探针H的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；用于检测病毒外参的引物探针组I，所述引物探针组I包括引物I1、引物I2和探针I；其中，引物I1的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，引物I2的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，探针I的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。2.一种如权利要求1所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：获取目的检测靶标；对所述目的检测靶标进行序列分析，获得目的序列组；基于所述目的序列组，获得备选引物组；根据备选引物的序列组，获得特异杂交探针组；将所述备选引物组和所述特异杂交探针组进行优化处理，获得多重引物探针组。3.根据权利要求2所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法，其特征在于，所述对所述目的检测靶标进行序列分析，获得目的序列的步骤，包括：对所述目的检测靶标进行序列分析，获得特异序列片段作为目的序列。
4.根据权利要求2所述检测即食果蔬中致病微生物的引物探针的制备方法，其特征在于，所述基于所述目的序列，获得备选引物的步骤，包括：基于所述目的序列，设计获得第一备选引物；采用标准模板对所述第一备选引物进行扩增效率测试，获得第二备选引物；将所述第二备选引物以非目的检测靶标为模板进行特异性测...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨丹妮，贾卫昌，耿成钢，高蕙文，袁荷芳，张晓金，邹雨虹，蒋静娴，李文静，周航，
申请(专利权)人：四川华汉三创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：