一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物。可以快速高效地检测非洲猪瘟病毒，毒株类型鉴定，特异性高、灵敏度高且成本较低，检测周期短，有良好的应用前景。有良好的应用前景。有良好的应用前景。

A PCR primer and probe composition for detecting African swine fever virus

The invention provides a PCR primer and probe composition for detecting African swine fever virus. It can detect African swine fever virus quickly and efficiently, identify the type of virus strain, have high specificity, high sensitivity, low cost, short detection cycle, and have good application prospects. It has a good application prospect. It has a good application prospect< br/>

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，具体为一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(african swine fever)，是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。
[0003]P72是ASFV病毒的保守结构蛋白，决定着非洲猪瘟病毒的种系进化常被用于作为ASFV的鉴定基因，也是目前公认的诊断常用区域。
[0004]CD2V蛋白是病毒吸附红细胞活性所必须的重要蛋白，从功能上来说属于宿主免疫调控相关蛋白，CD2V蛋白由ASFV EP402R基因编码，相关研究表明，与野生病毒株相比，缺失EP402R的重组毒虽然不能降低猪群死亡率，但可以推迟病毒的扩散时间(Borca MV，Carrillo C，Zsak L，et al.Deln in domestic swine.J Virol.1998Apr；72(4):28819.)。MGF是ASFV病毒编码中另一个具有免疫抑制特性的蛋白成分，有关etion of a CD2 like gene，8DR，from African swine fever virus affects viral infectioASFV的第一个减毒候选疫苗就是通过敲减MGF实现的(O'Donnell V,Holinka LG,Gladue DP，et al.African Swine Fever Virus Georgia Isolate Harboring Deletions of MGF360 and MGF505Genes Is Attenuated in Swine and Confers Protection against Challenge with Virulent Parental Virus.J Virol.2015Jun；89(11):604856.)。目前对于ASFV的减毒候选株研究大多集中于CD2V与MGF两个区域。目前，对于非洲猪瘟感染情况的检测，不仅需要确诊传染源，还需要精准确定毒株类型。
[0005]非洲猪瘟的实验室诊断方法有：红细胞吸附试验，直接免疫荧光试验，间接免疫荧光试验，酶联免疫吸附试验，免疫电泳试验，间接酶联免疫蚀斑试验、普通PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR技术，普通PCR成本较低，操作方便，得到了广泛应用，但普通PCR诊断存在灵敏度与特异性低的缺点，且ASFV会存在一定的潜伏期，普通PCR灵敏度较差，易造成漏检。TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术以及包括多重实时荧光PCR技术等在一定程度上大大提高了灵敏度和特异性，但对于病毒载量低的临床样本，其实还不足够灵敏，容易造成假阴性诊断。传统的巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应，使用两对PCR引物扩增目的片段。经过两次PCR扩增，可以极大程度的提高普通PCR的灵敏度，且二次PCR引物发生非特异性结合的概率极低，但是该方法为两步法，能对病毒检测足够灵敏，但是有繁琐步骤，而且开盖容易造成PCR产物交叉污染等缺点，不适用于临床实验室开展对非洲猪瘟病毒的
检测。
[0006]本专利技术提供了一种利用一步法巢式PCR技术(One
‑
step Nested
‑
qPCR Technology)，通过锁核苷酸修饰外侧引物提高退火温度增加与内侧引物退火温差，通过PCR反应条件，先高退火温度条件下，外侧引物优先扩增，降低退火温度后内侧引物同时扩增，外侧引物扩增产物同时与基因组DNA为模板，形成外
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外，外
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内，内
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外，内
‑
内PCR产物，远远大于&gt;2
n
指数扩增，从而提高检测灵敏度，同时本专利技术提供了用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是在于提供了一种快速简便的用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物。其具有特异性高、灵敏度高的特点，且成本较低，检测周期短，有良好的应用前景。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物，所述的引物和探针组合物包括第一组合物，所述的第一组合物包括针对非洲猪瘟病毒P72基因的两对引物和一条探针，所述两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物；所述两条外侧引物包括第一外侧引物和第二外侧引物；所述两条内侧引物包括第一内侧引物和第二内侧引物；所述探针为第一探针；所述第一外侧引物序列如SEQ ID No.1所示；所述第二外侧引物序列如SEQ ID No.2所示；所述第一内侧引物序列如SEQ ID No.3所示；所述第二内侧引物序列如SEQ ID No.4所示；所述第一探针序列如SEQ ID No.5所示。
[0009]在优选的实施方式中，所述的第一外侧引物序列自SEQ ID No.1所示的序列的5
’
端起第12位的G和第18位的G存在锁核酸修饰；所述的第二外侧引物序列自SEQ ID No.2所示的序列的5
’
端起第14位的C和第17位的G存在锁核酸修饰。
[0010]在一个实施方式中，所述的PCR引物和探针组合物还包括第二组合物和/或第三组合物。
[0011]所述第二组合物包括针对非洲猪瘟病毒MGF基因的两对引物和一条探针，所述的两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物，所述两条外侧引物包括第三外侧引物和第四外侧引物；所述两条内侧引物包括第三内侧引物和第四内侧引物；所述探针为第二探针；所述第三外侧引物序列如SEQ ID No.6所示；所述第四外侧引物序列如SEQ ID No.7所示；所述第三内侧引物序列如SEQ ID No.8所示；所述第四内侧引物序列如SEQ ID No.9所示；所述第二探针序列如SEQ ID No.10所示。
[0012]在优选的实施方式中，所述第二探针序列自SEQ ID No.10所示的序列的5
’
端起第4位的G、第9位的C和第13位的G存在锁核酸修饰。
[0013]所述第三组合物包括针对非洲猪瘟病毒CD2V基因的两对引物和一条探针，所述两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物，所述两条外侧引物包括第五外侧引物和第六外侧引物；所述两条内侧引物包括第五内侧引物和六内侧引物；所述探针为第三探针；所述第五外侧引物序列如SEQ ID No.11所示；所述第六外侧引物序列如SEQ ID No.12所示；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测非洲猪瘟病毒的PCR引物和探针组合物，所述引物和探针组合物包括第一组合物，所述的第一组合物包括针对非洲猪瘟病毒P72基因的两对引物和一条探针，所述两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物；所述两条外侧引物包括第一外侧引物和第二外侧引物；所述两条内侧引物包括第一内侧引物和第二内侧引物；所述探针为第一探针；所述第一外侧引物序列如SEQ ID No.1所示；所述第二外侧引物序列如SEQ ID No.2所示；所述第一内侧引物序列如SEQ ID No.3所示；所述第二内侧引物序列如SEQ ID No.4所示；所述第一探针序列如SEQ ID No.5所示。2.根据权利要求1所述的PCR引物和探针组合物，其特征在于，所述PCR引物和探针组合物还包括第二组合物和/或第三组合物；所述第二组合物包括针对非洲猪瘟病毒MGF基因的两对引物和一条探针，所述两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物，所述两条外侧引物包括第三外侧引物和第四外侧引物；所述两条内侧引物包括第三内侧引物和第四内侧引物；所述探针为第二探针；所述第三外侧引物序列如SEQ ID No.6所示；所述第四外侧引物序列如SEQ ID No.7所示；所述第三内侧引物序列如SEQ ID No.8所示；所述第四内侧引物序列如SEQ ID No.9所示；所述第二探针序列如SEQ ID No.10所示。所述第三组合物包括针对非洲猪瘟病毒CD2V基因的两对引物和一条探针，所述两对引物包括两条外侧引物和两条内侧引物，所述两条外侧引物包括第五外侧引物和第六外侧引物；所述两条内侧引物包括第五内侧引物和六内侧引物；所述探针为第三探针；所述第五外侧引物序列如SEQ ID No.11所示；所述第六外侧引物序列如SEQ ID No.12所示；所述第五...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳艳，王雪莹，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：