用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针、试剂盒及检测方法。本发明专利技术提供的引物组可特异、灵敏扩增非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型，该检测方法操作简单、快速准确、特异性好、灵敏度高、基因型覆盖全面，不存在漏检的可能性。存在漏检的可能性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物探针、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒 p72基因的引物探针组、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种热性、急性、亚急性的猪传染病，对猪有致病性，特征是烈性出血、高热、病理周期短，发病死亡率极高，一旦爆发必然导致整个养猪业损失巨大。
[0003]非洲猪瘟病毒是一种直径为200nm的正20面体双链DNA病毒，病毒基因组包含125kb的保守中心区域和2个可变末端，病毒基因组长度的差异与左右可变区的多基因家族成员片段的插入与缺失有关。非洲猪瘟病毒可以编码34种以上的结构蛋白，主要结构蛋白有在细胞吞噬中起作用的P50蛋白，诱导机体产生中和抗体的VP73蛋白，具有高度保守区的VP72蛋白，膜相关蛋白J5R蛋白，免疫调节蛋白A388L和CD2v蛋白。这些病毒表达的蛋白质能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞。而病毒在家猪中传播也是由于CD2v蛋白的表达，同时该蛋白损坏了淋巴细胞的功能。非洲猪瘟病毒基因组庞大复杂，具有明显的遗传多样性。根据编码主要衣壳蛋白p72 的B646L序列，非洲猪瘟病毒可分为24个基因型。由于非洲猪瘟病毒的感染机制极为复杂，基因型多，目前尚未研制出有效的疫苗进行防控，只能通过捕杀患病猪切断传染源，无害化处理，从而控制疫病传播，所以早期的非洲猪瘟病毒检测是防控重点。因此快速、准确的检测技术对预防和控制其传播具有重要意义。目前，国内外报道的非洲猪瘟病毒检测方法主要有常规 PCR、实时荧光PCR和等温扩增RPA和RAA法等。Luo Yuzi等依据非洲猪瘟病毒的vp72基因建立了一种常规PCR检测方法，对来自不同地理区域的 14株非洲猪瘟病毒进行检测，可以覆盖基因II型菌株，Felicity J Haines等建立了RT
‑
qPCR方法，用于同时鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒，可以对非洲猪瘟病毒vp72基因24个基因型中的8个基因型进行检测。可见，目前现有的方法检测非洲猪瘟病毒的vp72基因不能全部涵盖非洲猪瘟病毒的24个基因型，这样会导致漏检，出现假阴性，且现有方法有些灵敏度低的问题，这也是造成假阴性的一个原因。非洲猪瘟病毒具有随着猪制品国际贸易而跨境传播的极大风险，如何建立涵盖非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72基因24个基因型、灵敏度高的检测方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针、试剂盒及检测方法。该引物组可特异、灵敏扩增非洲猪瘟病毒p72基因24个基因型，该检测方法操作简单、快速准确、特异性好、灵敏度高、基因型覆盖全面，不会存在漏检的可能性。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：
[0006]用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针，其包括第一组引物对 p72
‑
F1和
p72
‑
R1及探针p72
‑
P1，和第二组引物对p72
‑
F2和p72
‑
R2及探针 p72
‑
P2，其中，所述p72
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述p72
‑
R1 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述p72
‑
P1的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述p72
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F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述p72
‑
R2 的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述p72
‑
P2的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
[0007]一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的实时荧光恒温扩增的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的引物对和探针，在探针的5
’
端和3
’
端分别标记报告基团和淬灭基团。
[0008]如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括dNTP Mixture、PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶。
[0009]如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含有核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示序列的阳性质粒，所述空白对照为去核酸的超纯水。
[0010]一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的的检测方法，其包括如下步骤：
[0011]S1、从样品中提取DNA；
[0012]S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用如上所述的用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针组；
[0013]S3、结果判定：
[0014]若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值<35，则判断为阳性；
[0015]若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值>45则判断为阴性；
[0016]若Ct值在35
‑
45之间，建议重复实验，若Ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
[0017]如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，探针的5
’
端和3
’
端分别标记FAM和BHQ为报告基团和淬灭基团。
[0018]如上所述的检测方法，优选地，在步骤S2中，所述实时荧光qPCR的反应体系包括0.1～2.5mmol/L dNTP Mixture、1～5
×
PCR缓冲液、1.0～2.5mmol/L MgCl2、0.05～0.2U/μL Taq DNA聚合酶、0.2～0.8μmol/L引物对、 0.16～0.28μmol/L探针和DEPC处理水。
[0019]进一步地，所述实时荧光qPCR的反应体系为25μL包括含有终浓度为 0.2mmol/L dNTP Mixture、1
×
PCR缓冲液、2mmol/LMgCl2、0.1U/μLTaq DNA 聚合酶、0.4μmol/L引物对、0.24μmol/L探针。
[0020]具体地，实时荧光qPCR扩增的反应体系总体积为25μL，其中，所述反应体系中包括2.5mmol/L dNTP Mixture 2.0μL、5
×
PCR缓冲液5.0μL、 25mmol/L MgCl22.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、引物组2μL(包括： 10μmol/L正向引物p72
‑
F1 1.0μL、10μmol/L反向引物p72
‑
R1 1.0μL、10μmol/L 探针p72
‑
P1 0.6μL，10μmol/L正向引物p72
‑
F2 1.0μL、10μmol/L反向引物 p72
‑
R2 1.0μL、10μm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物和探针，其特征在于，其包括第一组引物对p72
‑
F1和p72
‑
R1及探针p72
‑
P1，和第二组引物对p72
‑
F2和p72
‑
R2及探针p72
‑
P2，其中，所述p72
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述p72
‑
R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述p72
‑
P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述p72
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述p72
‑
R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述p72
‑
P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因的实时荧光恒温扩增的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物对和探针，在探针的5
’
端和3
’
端分别标记报告基团和淬灭基团。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP Mixture、PCR缓冲液、MgCl2、Taq DNA聚合酶。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和空白对照，所述阳性对照为含有核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示序列的阳性质粒，所述空白对照为去核酸的超纯水。5.一种用于检测非洲猪瘟病毒p72基因实时荧光qPCR扩增的的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、从样品中提取DNA；S2、对步骤S1提取的所述DNA进行实时荧光qPCR扩增；其中，在反应体系中，采用如...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹际娟，郑秋月，杨莉莉，吕美慧，陈莉丽，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：