一种定向EPC样细胞、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种定向EPC样细胞的制备方法，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。本发明专利技术的有益效果：本发明专利技术采用内皮祖细胞培养基预诱导脂肪干细胞3天，获得CD133表达率为47.63±12.50%、vWF表达率为31.10±5.32%的异质性的CEL，CEL能提高损伤部位血供，缓解缺血症状，不仅对于损伤区域的结构性修复是有益的且对于减轻神经功能损伤是有益的，CEL通过重建损伤区域的组织结构，恢复血液供应，抑制感染环境，减少神经元凋亡，促进轴突再生和突触连接，也能恢复部分感觉和运动功能。

A directional EPC like cell, preparation method and application thereof

The present invention discloses a preparation method of directional EPC like cells, including the following steps: S1. collecting fat and separating adipocytes; S2. adipocytes are cultured by ADSCs medium to obtain ADSCs of P2 generation; S3.P2 generation ADSCs is cultured by EPCs medium to obtain directional EPC like cells. The beneficial effect of the invention is that the invention adopts the endothelial progenitor cell culture medium to preinduce adipose stem cells for 3 days, obtaining the heterogeneity of CEL with the expression rate of 47.63 + 12.50% and the vWF expression rate of 31.10 + 5.32%. The CEL can improve the blood supply of the injured part and alleviate the ischemic symptoms. It is not only beneficial to the structural repair of the damaged area, but also beneficial to the damaged area. It is beneficial to reduce the injury of nerve function. By reconstructing the tissue structure of the damaged area, CEL can restore the blood supply, inhibit the infection environment, reduce the neuron apoptosis, promote the axon regeneration and synapse connection, and also restore some sensory and motor function.

【技术实现步骤摘要】
一种定向EPC样细胞、制备方法及其应用
本专利技术涉及细胞培养
，具体来说，涉及一种定向EPC样细胞、制备方法及其应用。
技术介绍
神经系统退行性改变和损伤后的再生修复与功能重建一直是神经科学领域的重大课题。结构重建包括神经元新生和再生、轴突生长和突触连接。近年来，几种干细胞类型已经用于脑损伤的再生医学研究，包括胚胎干细胞（embryonicstemcells，ESCs）、诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，IPSs）、神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）、神经胶质细胞、间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）、内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）等。早期的研究多通过ESCs、iPCs来源的神经前体细胞或成体NSCs移植治疗神经损伤，修复神经元，虽然能改善神经功能，但没有任何证据表明外源NSCs及其衍生细胞的植入活性，以及长期的神经元修复和突触连接，更引起诸如癫痫等异常神经活动。就目前的研究进展，以现有的技术实现体内神经元新生和再生是很困难的，但修复脑损伤区域微环境、减少炎症、恢复病灶血供，以及构建轴突生长和突触连接niche是可行的。对于绝大多数外伤、中风等脑损伤，神经元、神经胶质细胞、周细胞、内皮细胞等细胞损失或功能失调，是导致神经功能丧失的根本原因，有效重建神经组织结构和功能需要多种细胞的共同作用。其中因血管栓塞或破裂引起的出血导致病灶缺乏血供、诱发炎症，是导致病灶区神经胶质细胞、神经元损失或功能异常的重要原因之一。近来对MSCs的神经损伤修复效应的研究取得了很大进展，MSCs能通过旁分泌作用和免疫调节功能抑制炎症、减少纤维化和疤痕形成、诱导内源神经修复的作用看起来更值得期待。但MSCs移植疗效一直存在争议：1）异质性的MSCs细胞群体，其中效应细胞是什么2）MSCs的免疫调节功能存在双面性；3）极少的植入潜力，依靠短期的旁分泌作用诱导固有的组织修复，其再生医学作用不明确；4）体内存活期短；5）体内发育行为与体外分化能力之间存在巨大差异。因此MSCs更像一种多种生长因子、细胞因子、激素等的载体在体内起作用。在没有充分鉴定MSCs的不同细胞亚群特征及其标准化制备体系之前，研究MSCs的体内效应的个体化差异得到了很多争议的结果。总之，在脑损伤医学领域，是先治疗微环境损伤还是先治疗神经损伤是存在争议的。因此，提出能够促进神经功能恢复的新方案来替代现有技术是十分必要的。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种定向EPC样细胞（committedEPC-like，以下简称为CEL），它能够有效参与微血管形成、减少星星胶质细胞增生和炎症反应、抑制了神经损伤、缩小病灶面积，促进神经功能恢复。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种定向EPC样细胞的制备方法，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。进一步地，所述ADSCs培养基为含有UltroserGserumsubstitute的UltraCULTURE。进一步地，所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品；地塞米松；重组人血管内皮生长因子；重组人碱性成纤维细胞生长因子；胰岛素样生长因子-1。进一步地，所述步骤S1进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；P0代ADSCs传代培养至P2代收获。进一步地，所述于37℃，5%CO2培养箱内培养至70-80%汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合。进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬P2代ADSCs，接种至培养器皿中，培养24小时，换EPCs培养基培养3天收获定向EPC样细胞。本专利技术的另一方面，提供一种定向EPC样细胞，其根据上述的方法制备而成。本专利技术的另一方面，提供上述定向EPC样细胞的应用，其在治疗由创伤引起的脑组织损害药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术采用内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，简称EPCs）培养基预诱导脂肪干细胞（adiposederivedstemcells，简称ADSCs）3天，获得CD133表达率为47.63±12.50%、vWF表达率为31.10±5.32%的异质性的CEL，CEL被证实能够有效参与微血管形成、减少星星胶质细胞增生和炎症反应、抑制了神经损伤、缩小病灶面积，促进神经功能恢复。使用本专利技术所述的定向EPC样细胞的制备方法制备得到的CEL，能提高损伤部位血供，缓解缺血症状，不仅对于损伤区域的结构性修复是有益的且对于减轻神经功能损伤是有益的，CEL通过重建损伤区域的组织结构，恢复血液供应，抑制感染环境，减少神经元凋亡，促进轴突再生和突触连接，也能恢复部分感觉和运动功能。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是P2代的ADSCs形态图；图2是ADSCs成骨分化的形态图；图3是ADSCs成脂肪分化的形态图；图4是ADSCs成软骨分化的形态图；图5是CEL诱导分化第3天的形态图图6是CEL诱导分化第18天的形态图；图7显示CEL接种到matrigel包被的24孔板中7天呈条索状类血管结构；图8是CEL吞噬DiI-Ac-LDL显示红色荧光；图9是P2代的ADSCs和CEL多个分子的表达率统计图；图10显示TBI后4周时皮质损伤区GFAP+星形胶质细胞（绿色）增生，NeuN+神经元（细胞核染色：红色）减少；图11显示DiL-CEL（红色）移植后，集中在撞击形成的凹陷部位，并向皮质内部迁移；图12显示DiL-CEL（红色）迁移到皮质内部，参与血管内皮构成；图13是图12方框内放大图；图14是显示迁移到皮质内的Dil-CEL（红色）不表达GFAP，表明没有发生星形胶质细胞分化；图15显示迁移到皮质内的Dil-CEL（红色）不表达CD68，表明没有发生巨噬细胞分化；图16和图17显示迁移到皮质内的Dil-CEL（红色）不表达NeuN和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。

【技术特征摘要】
1.一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代的ADSCs；S3.P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到定向EPC样细胞。2.根据权利要求1所述的一种预诱导ADSCs的制备方法，其特征在于，所述ADSCs培养基为含有UltroserGserumsubstitute的UltraCULTURE。3.根据权利要求1所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品；地塞米松；重组人血管内皮生长因子；重组人碱性成纤维细胞生长因子；胰岛素样生长因子-1。4.根据权利要求1所述的一种定向EPC样细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。5.根据权利要求1所述的一种定向EPC样...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪钿，苑春慧，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11