一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法技术

本发明专利技术属于培养基制备技术领域，公开了一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法，脂肪组织采集；ADSCs培养；制备A‑CM；制备无培养基ADSCs培养上清；制备CM‑透明质酸混合液；流式细胞术分析；利用ELISA法检测A‑CM中生物活性分子。实验表明，A‑CM和Fr‑CM涂抹均能显著抑制粉刺、丘疹、脓包、溃烂和结节，并防止皮损部位累及周围组织，其预防效应与CM浓度呈正相关，是一种预防痤疮的新方法；而生理盐水培养ADSCs获得的FrA‑CM含有多种生物活性成分，不含完全培养基中复杂的生物和化学成分，且具有与A‑CM相似的预防痤疮的潜能，是一种能完全替代A‑CM的原料。

【技术实现步骤摘要】
一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法
本专利技术属于培养基制备
，尤其涉及一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：痤疮是常见的慢性炎症型皮肤疾病，多发于青少年，临床表征为丘疹、粉刺、脓疱、囊肿以及结节，一般I度和II度痤疮可自愈，至多局部外用维A类药物或抗生素即可，但III度及IV度痤疮经常会导致皮损，即使及时采用外用-口服联合治疗，由于治疗周期较长，用药剂量较大，长期使用耐药性明显，使得患者的治疗依从性较差，极容易引起色素沉着、持久性红斑、凹陷性或肥厚性瘢痕等严重皮肤问题，严重影响患者心理健康和社交。2005年日本长崎大学NakagawaH等报道，人间充质干细胞移植能加速创口收口和愈合，降低疤痕纤维化程度，减小疤痕，促进角质层形成；2007年加拿大阿尔伯塔大学Wu.等发现间充质干细胞通过诱导真皮组织血管新生、重建组织结构、创面上皮化过程，加速创口收口、缩小疤痕；2011年美国费城儿童医院的Mackenzie等发现，在创口愈合和组织修复过程中，间质基质细胞起到了重要作用。既往的研究表明，干细胞移植的作用方式可能并不是通过外源细胞再生修复起作用的，而是通过干细胞分泌的生物活性物质诱导机体的固有修复能力起作用。近期有几个研究也证明，脂肪干细胞(ADSC)条件培养基(A-CM)中含有多种生物活性分子，具有抑制炎症、调节免疫细胞活性、促进间质细胞增殖和胶原分泌、减少肌纤维化、促进微血管网络新生和再生、调节毛囊周期等生理活性，对于皮肤损伤、炎症、毛囊脂肪代谢失调有一定的治疗效果。另外的研究证明间充质干细胞具有抑制痤疮丙酸杆菌的作用。但既往干细胞治疗痤疮的实验研究集中在干细胞或其条件培养基修复痤疮所带来的组织损伤、色素沉着方面。本专利技术拟以脂肪干细胞条件培养基预防痤疮的发生，为研究其中可能的机制奠定基础。最近的一些研究认为间充质干细胞移植治疗中观察到的治疗活性背后主要的驱动力是这些细胞分泌的旁分泌因子。这些因子能诱导凋亡以抑制损伤组织进一步变性。与正常的生理环境相比，在患病组织周围可检测到旁分泌梯度，以诱导组织特异性间充质干细胞向感染或损伤部位迁移，从而促进愈合。因此，间充质干细胞通过旁分泌作用维持以致增加损伤组织与干细胞壁龛之间的生物活性因子梯度从而加快恢复过程。因此，移植间充质干细胞条件培养基，即间充质干细胞体外培养过程中的培养上清，有助于损伤组织愈合和恢复为生理状态。间充质干细胞条件培养基治疗痤疮的研究也证明了这一点。2016年，ZhouBR.等采用脂肪来源的间充质干细胞条件培养基联合激光嫩肤治疗萎缩性痤疮疤痕，发现联合治疗显著提高受试者满意度，皮肤光滑度、弹性、水合度、经皮水流失、黑色素指数等生物物理指标显著改善，同时增加了皮肤胶原和弹性蛋白密度，并使其排列有序，对疤痕的治疗有明显疗效。2018年，ShanX等在使用脂肪来源的间充质干细胞和同源的条件培养基治疗新西兰大耳兔痤疮模型的实验中发现，间充质干细胞联合条件培养基治疗显著降低了炎症反应，对痤疮疤痕有显著的治疗效果，而且条件培养基在其中起到至关重要的作用，具有治疗痤疮和痤疮疤痕的前景。2019年，ParkCS等报道了采用激光嫩肤和脂肪来源的间充质干细胞条件培养基序贯治疗萎缩性痤疮疤痕的劈脸研究结果。结果显示，治疗2个月后，疤痕量减少了23.5％(治疗组)和15.0％(对照组)，皮肤毛孔减少了7.6％(治疗组)和15.9％(对照组)，而红斑则增加了2.8％(治疗组)和3.1％(对照组)。综合评价，激光嫩肤联合间充质干细胞条件培养基治疗对萎缩性痤疮瘢痕和皮肤毛孔改善了至少15.0％，因此，条件培养基能增强激光治疗萎缩性疤的疗效。2019年，El-DomyatiM等报道了10例微针联合羊水来源的间充质干细胞条件培养基导入治疗萎缩性痤疮疤痕的劈脸临床试验结果，同样证明了联合治疗比单独使用微针或单独使用条件培养基的治疗方法有更好的临床收益，并且有显著的胶原蛋白和弹性蛋白纤维改善，而且面部治疗部位表皮有显著的厚度增加。多个间充质干细胞条件培养基用于痤疮疤痕、改善皮肤质量的基础和临床研究都证明了条件培养基具有降低炎症反应、诱导损伤修复的作用。既往间充质干细胞的培养体系主要分为三类，分别是含血清的培养体系、含血清替代品的培养体系、成分限定的无血清培养体系。培养的细胞以ISSCT在2006年公布的间充质干细胞鉴定标准鉴定免疫表型，包括CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105，结果表明培养的细胞CD34、CD45、HLA-DR表达率低于2％，而CD73、CD90、CD105表达率高于95％，符合间充质干细胞的鉴定标准，证明我们培养的脂肪来源的细胞是间充质干细胞。采用三类培养体系制备的间充质干细胞条件培养基治疗痤疮，能够避免使用活细胞的各种限制，包括病原微生物污染、免疫排斥反应、致瘤性、异常分化等，但是三类用于培养间充质干细胞的培养基中均含有无法确定的或者非间充质干细胞分泌的其它极其复杂的成分，包括激素、细胞因子、基质蛋白成分，甚至含有异种蛋白，存在不可预估的与治疗目的无关的风险，以及质量控制困难的缺陷，因此制备比较纯粹的间充质干细胞分泌产物是条件培养基制备工艺中的重要问题。生理盐水是人血浆的等渗液，经常用于组织细胞清洗、细胞制剂制备液等。既往我们的研究发现，采用生理盐水作为细胞制剂的制备液时，其中的细胞持续分泌细胞因子，且在2-8℃条件下，维持7天不会损失间充质干细胞的生物学活性。综上所述，现有技术存在的问题是：现有干细胞治疗痤疮的实验研究集中在干细胞或其条件培养基修复痤疮所带来的组织损伤、色素沉着方面。以脂肪干细胞条件培养基预防痤疮的发生的研究尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基及制备方法。本专利技术是这样实现的，一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，包括以下步骤：步骤一，脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、运输。步骤二，ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和沉淀层。以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬细胞。步骤三，制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清。过滤上清液，收集滤液备用。步骤四，制备无培养基ADSCs培养上清(FrA-CM)：以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中培养。步骤五，制备CM-透明质酸(CM-HA)混合液：以终浓度0.1％的HA为增稠剂和保湿剂，以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA。将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用。步骤六，流式细胞术分析：以单克隆抗体与细胞悬液避光孵育，离心弃上清。以PBS重悬沉淀，上机检测。...

【技术保护点】
1.一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法包括以下步骤：/n步骤一，脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、运输；/n步骤二，ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和沉淀层；以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬细胞；/n步骤三，制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清；过滤上清液，收集滤液备用；/n步骤四，制备无培养基ADSCs培养上清：以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X10

【技术特征摘要】
1.一种预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法包括以下步骤：
步骤一，脂肪组织采集：在专业医师操作下，采用负压干性抽脂法采集腹部、腿部脂肪，采脂数量15-20mL，封闭在无菌一次性注射器中，于2-8℃保存、运输；
步骤二，ADSCs培养：剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，取脂肪层和沉淀层；以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，以ADSCs完全培养基重悬细胞；
步骤三，制备A-CM：P3代ADSCs培养过程中，收集接种后24h、48h、72h的培养上清各50mL，4℃，3000Xg，离心收集上清；过滤上清液，收集滤液备用；
步骤四，制备无培养基ADSCs培养上清：以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中培养；
步骤五，制备CM-透明质酸混合液：以终浓度0.1％的HA为增稠剂和保湿剂，以75mL注射用水无菌条件下溶胀1gHA；将CM、HA、生理盐水混合均匀，分装于无菌容器，于4℃保存备用；
步骤六，流式细胞术分析：以单克隆抗体与细胞悬液避光孵育，离心弃上清；以PBS重悬沉淀，上机检测；
步骤七，利用ELISA法检测A-CM中生物活性分子。


2.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述ADSCs培养具体包括：
(1)无菌条件下小心剔除脂肪组织中的小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，少见颗粒；以2倍体积的医用生理盐水重悬，500g离心，10分钟，取脂肪层和沉淀层；重复洗涤2次，小心吸弃表面油脂，收集脂肪层和沉淀层；
(2)以二倍体积的消化液重悬脂肪层和沉淀层，37度水浴，190r/min，震荡消化30分钟；吸弃上层油脂、悬浮絮状物；200目筛网过滤，收集滤液；1000rpm离心10分钟，弃上清，以PBS重悬，静置10分钟，吸弃悬浮物，300g离心，10分钟，弃上清；
(3)以生理盐水洗涤2次，以ADSCs完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为5X105/mL，接种至175cm2组织培养瓶中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合时收获；
(4)收获时吸弃培养上清，以生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；收集细胞悬液，400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代ADSCs；
(5)传代时，以ADSCs完全培养基重悬P0代细胞，按10000细胞/cm2接种，隔夜完全换液，培养至90％以上融合时收获，记为P1代ADSCs；继续传代至P2代时收获。


3.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述离心速率设定升速9降速1，离心时间为30min；收集上清后，以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。


4.如权利要求1所述预防兔耳痤疮的ADSCs条件培养基的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述制备无培养基ADSCs培养上清的方法具体包括：
以生理盐水重悬P3代ADSCs，调整细胞密度至1X107/mL，转移至无菌非组织处理培养瓶中，饱和湿度，5％CO2，37℃培养；收集接种后24h、48h、72h的细胞悬液各50mL，4℃，3000Xg，设定升速9降速1，离心30min，收集上清；以0.22um无菌滤器过滤上清液，收集滤液，-80℃冻存备用。


5.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：苑春慧，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11