一种复合细胞制剂、制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种复合细胞制剂、制备方法及其用途，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs，包括以下步骤：采集脂肪并分离出脂肪细胞；脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；所述P2代的ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP，以及上述复合细胞制剂在治疗由糖尿病引起的下肢动脉闭塞症药物中的应用。本发明专利技术有益效果：采用EPCs培养基诱导ADSCs培养，获得CD133表达率为68.72±11.60%，vWF表达率为75.91±9.83%的EPCs，无需采集骨髓或动员外周血，糖尿病下肢动脉闭塞症患者患部注射后能降低肢体痛感和冷感，侧支血管新生率100%；总生存率为78.12%，保肢生存率为68.00%，能够有效延长患者截肢时间。

A compound cell preparation, preparation method and its use

The invention discloses a composite cell preparation, preparation method and application thereof, which comprises: endothelial progenitor cells EPCs autologous platelet rich plasma PRP, autologous adipose derived stem cells ADSCs and ADSCs sources, including the following steps: collecting fat and isolated fat cells; fat cells were cultured in ADSCs medium was P2 with ADSCs; the P2 generation of ADSCs by EPCs medium P0 generation ADSCs source EPCs; collected from their own anticoagulant peripheral blood by centrifugation was PRP, and the composite cell preparations in the treatment of lower limb arterial occlusion caused by diabetes pharmacotherapy in. The invention has the beneficial effects induced by EPCs ADSCs medium, CD133 expression rate was 68.72 + 11.60%, the expression rate of vWF was 75.91 + 9.83% EPCs, without the acquisition of bone marrow or mobilized peripheral blood, arterial occlusive disease patients after injection can reduce limb pain and cold sensation, the collateral angiogenesis rate of 100%; the total survival rate was 78.12%, limb survival rate was 68%, can prolong the time of patients with amputation.

【技术实现步骤摘要】
一种复合细胞制剂、制备方法及其用途
本专利技术涉及细胞培养
，具体来说，涉及复合细胞制剂、制备方法及其用途。
技术介绍
下肢动脉硬化闭塞症(LowerextremityArteriosclerosisocclusivedisease，LEASO)是动脉粥样硬化累及下肢动脉导致动脉狭窄或闭塞而引起肢体缺血症状的慢性疾病，是全身动脉硬化性疾病在下肢的表现，主要是细胞、纤维基质、脂质和组织碎片的异常沉积，在动脉内膜或中层发生增生过程中复杂的病理变化。LEASO的临床症状主要取决于肢体缺血的发展速度和程度。闭塞性病变的范围无论怎样广泛，只要动脉阻塞的病变发展速度缓慢，即可使侧支循环有效地建立，分支血流相应地增加，血液供应得以补偿，从而使组织遭受缺血和缺氧的程度可以缓和，临床上甚至没有明显的缺血症状。如果病变发展较快，侧支循环建立不完全，代偿有限，患者可出现下肢凉、麻木、无力、间歇性跛行、静息痛、肢体缺血性溃疡、坏疽等临床症状。随病情进展，LEASO的药物治疗效果不佳，多采用血管腔内治疗和动脉血管搭桥手术治疗以重建DM-LEASO患者下肢远端血供，降低截肢率和死亡率。糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是下肢动脉粥样硬化闭塞症的高危发病因素。DM引起的下肢血管病变多累及远端动脉，口径细，且长段闭塞性病变居多，动脉血管搭桥术因缺乏远端流出道成为相对禁忌症。而血管腔内治疗虽然作为首选治疗方案，能治疗膝下长段血管闭塞，但部分DM患者无法经受血管腔内手术，以及部分患者DM累及的术后膝下血管急性闭塞率和再狭窄率很高，发展很快，肢体侧支循环无法及时代偿建立，截肢成为这两类患者的唯一选择。近20年来，细胞治疗技术的基础和临床研究发展迅速，针对DM及其并发症的细胞治疗技术也取得了一定进展。2002年TateishiYuyamaE等率先报道细胞移植治疗ASO的短期有效性，为治疗性血管新生理论提供了新的证据。血管新生包括两个方面，一方面是血管生成，另一方面是血管形成。前者是血管出芽形成新的血管，后者是在没有血管的情况下由内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)、成肌细胞、血管周细胞(pericytes，PCs)等相互作用形成新的血管。既往多个研究组证明骨髓干细胞(Bonemarrowstemcells,BMSCs)、动员外周血干细胞(Mobilized-peripheralstemcells,M-PBSCs)具有成血管作用，与其中含有的EPCs、间充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)有关。对DM-ASO患者自体EPCs的研究发现，DM导致患者EPCs增殖、迁移、粘附以及生存能力损失，血管生成能力降低，而异体EPCs移植受受体免疫排斥作用的影响，疗效甚差，EPCs移植的治疗性血管再生应用面临绝境，转而依赖于通过BMSCs或M-PMSCs移植或体外培养高增殖活性的自体EPCs再移植的补充疗法新策略。其后的研究也证明了这一点。BMSCs、M-PBSCs、脐带血干细胞(umbilicalcordbloodstemcells，UCBSCs)移植能重建血管网络，改善患者下肢侧支循环和血流灌注，患肢冷感、疼痛、间歇性跛行、溃疡明显好转。但BMSCs采集需有创采集骨髓，对于很多老年患者和疾病患者存在障碍，且影响患者生存质量，而UCB-MNCs和M-PBMSCs单独移植治疗DM-LEASO时，耐缺氧环境能力较差，存活期短。寻找新的种子细胞成为细胞移植治疗DM-LEASO的关键。MSCs存在于多种组织，包括脂肪组织和骨髓组织，外周血中含量较少。有文献报道血管周细胞是一种MSCs，能调控内皮细胞增殖分化，进而调控血管生成，另外的研究也表明多种组织来源的MSCs具有成内皮分化潜能。而动物实验结果表明，自体骨髓-MSCs、脂肪-MSCs移植治疗DM-LEASO时，具有更强的缺氧环境耐受能力，存活期长，诱导血管新生潜能低于BMSCs或与之相当，但进一步的研究表明，MSCs在血管新生过程中是通过旁分泌起作用的，而没有直接参与血管新生，其作用更趋向于通过调节免疫功能诱导构建血管新生微环境。鉴于BMSCs、M-PBSCs、UCBSCs、MSCs、EPCs均具有诱导血管新生的作用，但任何单一细胞成分均有不同的缺陷。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种复合细胞制剂的制备方法，能够显著减轻了患者的肢体疼痛和冷感，有效延长患者截肢时间。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种复合细胞制剂，其包含：自体富血小板血浆(Platelet-richplasma，以下简称PRP)、自体脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells，以下简称ADSCs)和ADSCs来源的内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells，以下简称EPCs)。进一步地，以含2％CaCl2的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2x107/mL，再按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，得到所述复合细胞制剂。本专利技术的另一方面，提供了复合细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；S3.所述P2代自体ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；S4.采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP。进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以ADSCs培养基重悬P2代自体ADSCs，接种至培养器皿中培养，换EPCs培养基培养6天收获P0代ADSCs来源的EPCs。进一步地，所述步骤S5进一步包括如下步骤：采集受者自身枸橼酸钠抗凝外周血，离心收取上清及部分红细胞；再次离心弃去上部上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层。进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37℃，5％CO2培养箱内培养至70-80％汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代自体脂肪干细胞；P0代自体脂肪干细胞传代培养至P2代收获。进一步地，所述于37℃，5％CO2培养箱内培养至70-80％汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80％汇合。进一步地，所述ADSCs培养基为含有UltroserGserumsubstitute的UltraCULTURE；所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品、地塞米松、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合细胞制剂，其特征在于，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs。

【技术特征摘要】
1.一种复合细胞制剂，其特征在于，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs。2.根据权利要求1所述的一种复合细胞制剂，其特征在于，以含2%CaCl2的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2x107/mL，再按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，得到所述复合细胞制剂。3.制备权利要求1所述复合细胞制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.采集脂肪并分离出脂肪细胞；S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；S3.所述P2代自体ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；S4.采集受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以ADSCs培养基重悬P2代自体ADSCs，接种至培养器皿中培养，换EPCs培养基培养6天收获P0代ADSCs来源的EPCs。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S5进一步包括如下步骤：采集受者自身抗凝外周血，离心收取上清及部分红细胞；再次离心弃去上部上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤，采用腹部皮下抽脂，剔除小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪钿，苑春慧，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11