一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法技术

本发明专利技术公开了一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60‑70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。本发明专利技术提出的MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。

A method for the axon growth of MSCs derived Schwann cell nourishing sensory neurons

The invention discloses a method for sensory neuron axon Schwann cells nourish a MSCs derived growth, which comprises the following steps: S1. in neonatal umbilical cord Wharton's jelly by MSCs medium P2 MSCs S2. to MSCs generation of umbilical cord; medium suspension P2 generation were inoculated with recombinant human umbilical cord MSCs, laminin, recombinant human. Fibronectin coated cell culture plate cultured to the 60 70% confluence, change the neural differentiation medium prepared neural epithelial cells induced by S3. pretreatment; neural epithelial cells induced by SCs pre cultured P0 SCs and subcultured to P1 generation; S4. with P1 SCs SCs was prepared by trophoblast; preparation of S5. DRG cells in sensory neurons, sensory neurons and DRG SCs cells were co cultured trophoblast. The method of MSCs derived axonal growth of Schwann cells nourishing and sensing neurons is provided by this invention, which provides a new way for cell repair of nerve damage in central nervous system.

【技术实现步骤摘要】
一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体来说，涉及一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法。
技术介绍
神经损伤发生时，神经元的再生是非常困难的，但残留神经元的轴突再生、生长和突触再连接是神经功能恢复的关键。神经损伤修复经轴突芽生、再生轴突生长和延伸、神经功能恢复三个阶段。既往的研究发现细胞外基质粘附分子、NGF、BDGF、NT-3、FGF、神经递质、生物活性磷脂等细胞外基质分子，可调节神经元轴突的形成、引导、延伸、分支、转向、暂停、回缩等，影响神经元的形态结构。但在体内局部注射这些成分对损伤修复有较好的作用，但对轴突再生以及神经功能修复的作用并不显著，推测与神经轴突生长基质细胞微环境有关。神经发育生物学的研究发现，在发育阶段，SCs由一种前体细胞发育成形态学和功能上完全不同的两类，即髓鞘形成细胞和非髓鞘形成细胞。以上两类细胞的分化是可逆的，如果神经离断后，这两类细胞都可回复到发育早期的“活跃细胞”阶段，这种活跃细胞也覆盖神经-肌肉接口处。有学者发现肌肉神经切断后，很快就有终末Sc伸出突起长入肌肉，长度达几百毫米。另外的研究发现，神经横断后，远端植入SCs细胞，轴突很快长入移植物中，能建立与远端实质的天然联系。因此雪旺细胞可能具有构建轴突复建细胞微环境的作用，引导和促进轴突生长。既往用于实验研究和移植研究的SCs一般取自自体神经周围组织，会造成额外的损伤，且体外分离、培养困难。随着干细胞研究的发展，科学家发现采用胚胎干细胞、诱导多能干细胞也能大量制备SCs，但广泛的移植成瘤性等严重不良反应限制了其临床研究发展。近些年对间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）多潜能性的研究取得长足的进步，发现类似于胚胎干细胞诱导SCs的方法经多步诱导可以体外制备SCs。但其诱导体系比较复杂，操作繁琐。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。进一步地，所述MSCs培养基为含2%血清替代物的无血清培养基。进一步地，所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，10%无动物源成分血清替代品，5nM人二氢睾丸酮，20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL重组人表皮生长因子，40ng/ml全反式维甲酸。进一步地，所述SCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，10%无动物源成分血清替代品，5nM人二氢睾丸酮，10ng/mLrhb-FGF，10uM毛喉素，5ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。进一步地，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为P1代脐带MSCs，将P1代继续培养至P2代。进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养4天，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以SCs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的培养板中，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面，加入AccutaseTM消化液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代SCs，P0代SCs传代培养至P1代时收获。进一步地，所述步骤S4进一步包括如下步骤：以SCs培养基重悬P1代SCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β包被的培养板中，培养至24小时，换含3%FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为SCs滋养层。进一步地，所述步骤5进一步包括如下步骤：断颈处死成年雄性Wistar大鼠，手术取DRG，以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG，600g离心10分钟，弃上清；以胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟后终止，离心弃上清；沉淀以生理盐水洗涤，以移液管抽吸吹打，离心弃上清，沉淀为DRG感觉神经元细胞；以含3%FBS的DMEM/F12重悬DRG感觉神经元细胞，调整细胞密度；吸弃SCs滋养层培养基，再接种DRG感觉神经元细胞悬液，37℃，5%CO2条件下共培养48小时。本专利技术的有益效果：本专利技术所述的MSCs来源的SCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，采用MSCs来源的SCs与成年大鼠背根神经节（Dorsalrootganglia，DRG）感觉神经元共培养48小时，86.42+/-11.72%的DRG感觉神经元轴突生长，平均生长长度为426.23+/-114.01um，远超过脐带MSCs（99.46+/-3.87um）和少突胶质前体细胞（oligodendrocyteprecursorcells，OPCs）（190.22+/-20.51um），为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。附图说明图1是华通氏胶组织块接种时的形态图；图2是华通氏胶组织块培养第14天时的形态图；图3是P2代脐带MSCs的形态图；图4是脐带P2代MSCs在重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板上生长的形态图；图5是神经上皮预诱导细胞形态的改变；图6是神经上皮预诱导细胞高表达nestin的形态图；图7是脐带MSCs来源的SCs高表达GFAP的形态图；图8是脐带MSCs和MSCs来源的SCs培养48小时分泌多种生物活性分子浓度比较图；图9是对照组DRG感觉神经元形态图；图10是脐带MSCs共培养组DRG感觉神经元形态图；图11是SCs共培养组DRG感觉神经元形态图。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂和实验器械未经特殊说明均可从本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60‑70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。

【技术特征摘要】
1.一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经SCs培养基培养得到P0代SCs，并传代培养至P1代；S4.以P1代SCs制备SCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以SCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。2.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述MSCs培养基为含2%血清替代物的无血清培养基。3.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，10%无动物源成分血清替代品，5nM人二氢睾丸酮，20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL重组人表皮生长因子，40ng/ml全反式维甲酸。4.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述SCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，10%无动物源成分血清替代品，5nM人二氢睾丸酮，10ng/mLrhb-FGF，10uM毛喉素，5ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。5.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪钿，苑春慧，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11