提高神经前体细胞的迁移的方法技术

本发明专利技术提供了关于通过增加神经前体细胞中ＴＭＥＭ１８蛋白的水平来提高神经前体细胞的迁移的方法。所述方法可用于疾病治疗，其包括神经胶质瘤或神经变性疾病的治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术主要涉及向神经组织内的部位递送神经祖细胞的方法。
技术介绍
神经胶质瘤是最常见类型的颅内肿瘤，并且趋向于快速侵入脑中。神经胶质瘤起 源于神经胶质细胞，主要起源于星形胶质细胞，并且随着恶性程度的增加分成I IV级。 IV级神经胶质瘤，又称作多形性成胶质细胞瘤(GBM)，包括几乎一半的神经胶质瘤，并且在 成年人中是最常见的原发性脑瘤。GBM目前几乎不可治愈。即使使用外科手术、放射疗法和 化学疗法，患有GBM的病人通常在大约一年内死亡，仅仅少数病人存活超过3年。因此，对 神经胶质瘤的治疗和疗法已成为癌症治疗的主要焦点。 神经胶质瘤是所有癌症中最致命的并且对当前治疗的效果不明显。神经胶质瘤的 高致死率可归因于神经胶质瘤细胞侵入周围健康脑组织的能力。神经胶质瘤细胞利用生 长因子、蛋白酶以及细胞外基质和细胞表面蛋白的错误调节而获得破坏性的侵入能力(在 Tysnes等人，2001 ;Mueller等人，加O3中评述)。 目前的神经胶质瘤的治疗方法的失败主要是由于肿瘤细胞广泛侵入周围健康脑 组织从而逃避限局性治疗的这种能力。由于限局性治疗如此无效而全面治疗对脆弱的脑部 损害太大，所以优选的方案是找到能够明确定位于肿瘤细胞的治疗方法。
技术实现思路
在一个方面中，提供了一种提高神经前体细胞向分泌神经前体细胞趋化因子的细胞的迁移的方法，该方法包括增加神经前体细胞中TMEM18的水平。 在另一个方面中，提供了一种TMEM18的水平增加的神经前体细胞。 在另一个方面中，提供了一种包含TMEM18的水平增加的神经前体细胞的药物组合物。 在另一个方面中，提供了 TMEM18的水平增加的神经前体细胞用于治疗神经疾病 的用途，包括TMEM18的水平增加的神经前体细胞在制备用于治疗神经疾病的药物中的用 途。 在本专利技术不同方面的各种实施方式中，TMEM18可包含SEQ ID NO. :1 SEQ ID NO. :5中任一项所述的氨基酸序列。 所述神经前体细胞可来自胚胎干细胞或来自神经组织。神经前体细胞可被修饰包 括标记分子或治疗剂。神经前体细胞可包含编码TMEM18的表达载体，并且可包含编码治疗 性蛋白或肽的表达载体。因此，所述神经前体细胞可用于治疗神经疾病。3 所述分泌神经前体趋化因子的细胞可为神经胶质瘤细胞或位于神经组织变性部 位的细胞。 神经前体趋化因子可包括基质细胞衍生因子、单核细胞趋化蛋白、细胞因子干细胞因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、干细胞因子或成纤维细胞生长因子。增加TMEM18的水平可包括提高神经前体细胞中天然TMEM18的表达水平或者在神经前体细胞中由表达载体表达重组TMEM18。 当前描述的方法可进一步包括将神经前体细胞递送到包括分泌神经前体趋化因 子的细胞的细胞群体中。该细胞群体可为体外或体内。递送可包括外科植入或注射。 结合附图，根据专利技术的具体实施方式的以下说明，对本领域普通技术人员而言，本 专利技术的其它方面和特点是明显的。附图说明 在图中，只通过实施例说明本专利技术的实施方式 图1 :鉴定作为调节神经前体细胞向神经胶质瘤细胞迁移的基因的TMEM18。 (A)用 来识别能够促进神经前体细胞向神经胶质瘤细胞迁移的蛋白的cDNA文库筛选的流程图。 用携带cDNA文库的逆转录病毒感染人神经前体细胞系，NT2。将被感染细胞平板接种到神 经胶质瘤细胞培养物上面的transwell迁移小室上。收集能够通过小室的孔迁移到小室 的膜的相对位置的神经前体细胞并使其经过两次以上的相同的迁移实验。通过PCR克隆 迁移细胞中的病毒引入的cDNA并测序。(B)TMpred程序预测TMEM18具有四个跨膜a -螺 旋(Hofman和Stoffel， 1993)。用TMpred图覆盖TMEM18蛋白质结构的示意性判读来图解 程序的结果。(C)序列比对人的TMEM18蛋白[SEQ IDNO. 1]、小鼠的TMEM18蛋白[SEQ ID NO. 2]、大鼠的TMEM18蛋白[SEQ IDNO. 3]、狗的TMEM18蛋白[SEQ ID NO. 4]和鸡的TMEM18 蛋白[SEQ ID NO. 5]。星号(*)表示氨基酸完全保守而冒号()表示序列中的一个氨基酸 不同。注意，狗的序列中仅显示了 [SEQ ID NO. :4]的C末端部分。加下划线的粗体序列表 示由PredictNLS程序(Cokol等人2000)预测的可能的核定位信号肽。 图2 :稳定的超量表达TMEM18的神经前体细胞系。 通过在NT2细胞和C17. 2细胞中进行常规RT-PCR(A，D)以及定量实时RT-PCR(B， E)检测慢病毒属引入的TMEM18的超量表达。结果显示不受感染的亲本细胞(对照)、空病 毒感染的对照细胞(载体对照)和两种神经前体细胞的每个类型的两个群体(TMEM18A和 B)。为了实时RT-PCR分析，使用P -肌动蛋白mRNA表达使TMEM18mRNA的表达标准化。(C) 显示NT2细胞中TMEM18的超量表达的免疫染色。 图3 :TMEM18的超量表达提高了神经前体细胞的迁移活性。(A，B)进行评价TMEM18 对非特异性细胞运动的影响的划痕实验的结果。以相同密度平板接种NT2(A)和C17.2(B) 细胞并且通过用移液管头刮而除去一层细胞。刮后24小时，检查空区域的恢复。(C，D)评 价TMEM18对神经前体细胞的神经胶质瘤特异性迁移的影响的Transwell迁移实验。(C) NT2 细胞向U87和H4神经胶质瘤细胞系与NIH3T3和293T非神经胶质瘤细胞系的迁移。(D) C17. 2细胞向U87和C6神经胶质瘤细胞系的迁移。结果呈现出与用对照病毒转导的细胞相 比的的成倍差别。使用t检验计算超量表达TMEM18的细胞与载体对照间的统计比较。一 个星号(*)、两个星号(**)和三个星号(***)分别表示小于0. 10、0. 05和0. 01的p值。 图4 :在大鼠脑中TMEM18的超量表达提高了 C17. 2神经前体细胞向C6神经胶质瘤细胞的迁移活性。将超量表达绿色荧光染料标记的TMEM18的C17. 2细胞与红色荧光染料标记的载体对照的C17. 2细胞混合并注射到与C6神经胶质瘤接种部位(右)对侧的大鼠脑部的左侧。两周后，在荧光显微镜下对脑部切片以进行细胞迁移检查。在A和B中的右侧的正方形表示细胞向肿瘤迁移的前面，其在C和D中高倍放大显示。E为C和D的合并图像。黄点表示绿色和红色荧光染料标记的细胞运动到一起。注意，许多超量表达绿色荧光染料标记的TMEM18的C17. 2细胞(箭头)单独迁移。 图5 :内源TMEM18表达的基因抑制(Knockdown)抑制细胞迁移。(A，B)如实时PCR定量所示，针对TMEM18转录物的短干扰RNA降低了内源TMEM18在NT2和C17. 2细胞中的表达。在NT2细胞中检测针对TMEM18的短干扰RNA的两种不同序列并得出TMEM18mRNA的四种不同的基因抑制水平。使用针对萤光素酶的siRNA作为对照。(C，D)TMEM18表达水平的下降同时降低了神经前体细胞向DMEM和U87MG的迁移活性。 图6 :TMEM18蛋白显示了覆盖核与胞质结构的定位形式。(A)使用免疫前血清(前血清)以及在超本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高神经前体细胞向分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的方法，该方法包括增加神经前体细胞中ＴＭＥＭ１８的水平。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-3-23 60/907,187一种提高神经前体细胞向分泌神经前体细胞趋化因子的细胞迁移的方法，该方法包括增加神经前体细胞中TMEM18的水平。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述分泌神经前体趋化因子的细胞为神经胶质 瘤细胞。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述分泌神经前体趋化因子的细胞为神经组织 变性部位的细胞。4. 根据权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述TMEM18包含SEQ ID NO. :1 SEQ ID NO. :5中任一项所述的氨基酸序列。5. 根据权利要求1 4中任一项所述的方法，其中，所述增加包括提高神经前体细胞中 天然TMEM18的表达水平。6. 根据权利要求1 4中任一项所述的方法，其中，所述增加包括在神经前体细胞中通 过表达载体表达重组TMEM18。7. 根据权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述神经前体趋化因子包括基质细 胞衍生因子、单核细胞趋化蛋白、细胞因子干细胞因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、 干细胞因子或成纤维细胞生长因子。8. 根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，所述神经前体细胞源自胚胎干细胞。9. 根据权利要求1 7中任一项所述的方法，其中，所述神经前体细胞源自神经组织。10. 根据权利要求1 9中任一项所述的方法，其中，该方法进一...

【专利技术属性】
技术研发人员：王朔，亚纳尤尔韦苏，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]