一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法技术

本发明专利技术公开了一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60‑70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经OPCs培养基培养得到P0代OPCs，并传代培养至P2代；S4.以P2代OPCs制备OPCs滋养层；S5.制备DRG感觉神经元细胞，以OPCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。本发明专利技术提出的MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。

A method for the axonal growth of MSCs derived OPCs nourishing sensory neurons

The invention discloses a method for MSCs derived sensory neurons axonal growth OPCs trophoblast, which comprises the following steps: S1. in neonatal umbilical cord Wharton's jelly by MSCs medium P2 MSCs S2. to MSCs generation of umbilical cord; medium suspension P2 generation were inoculated with recombinant human umbilical cord MSCs, laminin and recombinant human. Even protein coated cell culture plate cultured to the 60 70% confluence, change the neural differentiation medium prepared neural epithelial cells induced by S3. pretreatment; neural epithelial cells induced by OPCs pre cultured P0 OPCs and subcultured to P2 generation; S4. with P2 OPCs OPCs was prepared by trophoblast; S5. preparation of DRG sensory neurons to sensory neuron cells, OPCs and DRG were co cultured trophoblast. The MSCs derived OPCs nourishes the axonal growth of sensory neurons, which provides a new way for cell repair of nerve damage in central nervous system.

【技术实现步骤摘要】
一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法
本专利技术涉及细胞培养
，具体来说，涉及一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法。
技术介绍
神经系统退行性改变和损伤后再生修复与功能重建，一直是神经科学研究者亟待探索解决的重大课题及面临的最难以逾越的严峻挑战。由于中枢神经组织在结构上的脆弱性和功能上的复杂性，其损伤往往息味着巨大的、不可逆的破坏，严重影响患者生命安全与生活质量。神经系统损伤修复包括结构修复和功能恢复两个方面。结构修复涵盖神经元再生和新生、轴突生长和突触再连接。目前的医疗技术尚不能解决神经元再生和新生的难题，而轴突生长则是可控的一个方面。既往的研究表明，截瘫大鼠5%的残留神经纤维即可使瘫痪后肢恢复部分或全部关节运动；当残留达到10%时，截瘫动物甚至可以恢复部分行走功能；当残留比例超过40%时，大鼠后肢运动功能可达到正常。有理由推测，人类神经系统（脑和脊髓）退行性改变或损失只要10%~15%神经结构完整，即可保持近85%~90%功能，而如何促进神经纤维新生是恢复神经功能、改善生活质量的重要内容。目前，应用于临床治疗的药物大多起神经保护作用和（或）可能的神经修复作用，包括：神经节苷脂、脑蛋白水解物、三磷酸胞苷二钠、奥拉西坦等神经营养药物，硫酸软骨素、软骨素酶ABC等减弱抑制神经生长的药物，司来吉兰、肌酸、艾地苯醌等代谢药物，拉莫三嗪、利鲁唑等抗兴奋毒性药物，美金刚、瑞波西汀、利他林、他克林等神经递质性药物，但这些药物对轴突再生和新生以及神经功能恢复的作用极其有限。研究新的神经修复制剂或药物成为神经修复医学的重要课题。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经OPCs培养基培养得到P0代OPCs，并传代培养至P2代；S4.以P2代OPCs制备OPCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以OPCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。进一步地，所述MSCs培养基为含2%血清替代物的无血清培养基。进一步地，所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，1×N2，1uM1,25-二羟维生素D3，40ng/mL三碘甲状腺氨酸，0.5ug/mL人褪黑素，20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL重组人表皮生长因子。进一步地，所述OPCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，1×N2，2mML-谷氨酰胺，1uM1,25-二羟维生素D3，40ng/mL三碘甲状腺氨酸，0.5ug/mL人褪黑素，20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL重组人表皮生长因子，20ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，4ng/mL重组人神经营养因子3。进一步地，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为P1代脐带MSCs，将P1代继续培养至P2代。进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养4天，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以OPCs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面，加入AccutaseTM消化液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代OPCs，P0代OPCs传代培养至P2代时收获。进一步地，所述P0代OPCs传代培养的培养体系为：经OPCs培养基悬浮，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶。进一步地，所述步骤S4进一步包括如下步骤：以OPCs培养基重悬P2代OPCs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至24小时，换含3%FBS的DMEM/F12培养48小时备用，此为OPCs滋养层。进一步地，所述步骤5进一步包括如下步骤：断颈处死成年雄性Wistar大鼠，手术取DRG，以含0.1mg/mLNB4的DMEM/F12消化DRG，600g离心10分钟，弃上清；以胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟后终止，离心弃上清；沉淀以生理盐水洗涤，以移液管抽吸吹打，离心弃上清，沉淀为DRG感觉神经元细胞；以含3%FBS的DMEM/F12重悬DRG感觉神经元细胞，调整细胞密度；吸弃OPCs滋养层培养基，再接种DRG感觉神经元细胞悬液，37℃，5%CO2条件下共培养48小时。本专利技术的有益效果：本专利技术所述的MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，采用MSCs来源的OPCs与成年大鼠背根神经节（Dorsalrootganglia，DRG）感觉神经元共培养48小时，68.19±24.09%的DRG感觉神经元轴突生长，平均生长长度为190.22+/-20.51um，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。附图说明图1是华通氏胶组织块接种时的形态图；图2是华通氏胶组织块培养第14天时的形态图；图3是P2代脐带MSCs的形态图；图4是脐带P2代MSCs在重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的96孔板上生长的形态图；图5是神经上皮预诱导细胞形态的改变；图6是神经上皮预诱导细胞高表达nestin的形态图；图7是脐带MSCs来源的OPCs高表达A2B5的形态图；图8是脐带MSCs和MSCs来源的OPCs培养48小时分泌多种生物活性分子浓度比较图；图9是对照组DRG感觉神经元形态图；图10是脐带MSCs共培养组DRG感觉神经元形态图；图11是OPCs共培养组DRG感觉神经元形态图。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂和实验器械未经特殊说明均可从商业途径获得。首先，对本专利技术具体实施例中涉及的试剂、出现的英文及缩写进行简单的说明。UltraCULTURE：无血清培养基，生产厂商为LONZA，货号为12-725F；Ultros本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60‑70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经OPCs培养基培养得到P0代OPCs，并传代培养至P2代；S4.以P2代OPCs制备OPCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以OPCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。

【技术特征摘要】
1.一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.以新生儿脐带华通氏胶经MSCs培养基培养得到P2代脐带MSCs；S2.以MSCs培养基悬浮P2代脐带MSCs，接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；S3.以神经上皮预诱导细胞经OPCs培养基培养得到P0代OPCs，并传代培养至P2代；S4.以P2代OPCs制备OPCs滋养层;S5.制备DRG感觉神经元细胞，以OPCs滋养层与DRG感觉神经元细胞进行共培养。2.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述MSCs培养基为含2%血清替代物的无血清培养基。3.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述神经分化培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，1×N2，1uM1,25-二羟维生素D3，40ng/mL三碘甲状腺氨酸，0.5ug/mL人褪黑素，20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL重组人表皮生长因子。4.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述OPCs培养基为包含以下成分的DMEM/F12：1×B27，1×N2，2mML-谷氨酰胺，1uM1,25-二羟维生素D3，40ng/mL三碘甲状腺氨酸，0.5ug/mL人褪黑素，20ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子，20ng/mL重组人表皮生长因子，20ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，4ng/mL重组人神经营养因子3。5.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以MSCs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于CO2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为P0代脐带MSCs；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为P1代脐带MSCs，将P1代继...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪钿，苑春慧，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11