视网膜神经节细胞及其祖细胞制造技术

本发明专利技术提供了可任选地在无饲养层的条件下、以及进一步任选地在无异物的条件下，由多能干细胞生产视网膜神经节(RG)祖细胞和成熟RG细胞的方法。此外，本发明专利技术提供了RG祖细胞和成熟RG细胞的组合物、以及它们的使用方法，包括它们的治疗用途。示例性的方法可以生产RG祖细胞和成熟RG细胞的基本纯的群体和培养物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】视网膜神经节细胞及其祖细胞相关申请本申请要求2014年9月5日提交的标题为“RETINALGANGLIONCELLSANDPROGENITORSTHEREOF”的美国临时申请系列No.62/046,165的权益，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术介绍
视网膜疾病通常由于失去了有丝分裂后的神经元细胞而导致失明。视网膜疾病包括青光眼、色素性视网膜炎、视杆细胞或视锥细胞营养不良、视网膜退化、糖尿病视网膜病、黄斑退化、Leber先天性黑矇和Stargardt病。青光眼尤其涉及视网膜神经节(RG)细胞的损伤或退化。视网膜神经节(RG)细胞的潜在替代来源为干细胞，例如多能干细胞。早期的研究报告了由小鼠胚胎干细胞体外生成了视网膜前体细胞(Ikedaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.102(32):11331-11336,2005)；由出生后第1天小鼠的视网膜生成了视网膜祖细胞(Klassenetal.Invest.Ophthal.Vis.Sci.45(11):4167-4175,2004)；在视网膜退化的RCS大鼠模型中移植骨髓间充质干细胞(Inoueetal.Exp.EyeRes.8(2):234-241,2007)；由人类成纤维细胞分化成诱导的多能干细胞(iPS)，以产生视网膜祖细胞(Lambaetal.PLoSONE5(1):e8763.doi:10.1371/journal.pone.0008763)；以及由H1人类胚胎干细胞系产生视网膜祖细胞，包括无长突细胞、光感受器、双极细胞和水平细胞(Lambaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.10(34):12769-12774,2006)。在后面这些研究中，未成熟的和成熟的视网膜细胞均作为不同细胞类型的混合群体生成，并且推定的视网膜神经节细胞代表了群体中的一小部分。此外，用于识别特定细胞类型(包括神经丝,Tuj1和HuC/D)的标志物对视网膜神经节(RG)细胞和/或其前体不具有特异性。其中的一项研究基于Brn3的表达来鉴别细胞，发现很少细胞表达所述标志物。因此，这些方法均不能产生均质的或接近均质的视网膜神经节(RG)细胞或RG祖细胞的群体。这些方法均不能产生例如用于体外方法(例如筛选测试)或体内方法的足够数量的RG细胞或RG祖细胞。可从中分离RG细胞的供体衍生的组织(例如尸体、胎儿组织和活的动物)的供应是有限的。培养原代RG细胞的尝试已得到了持续至多大约2周的培养物，此后成熟的RG细胞不再有活力。尚未报告原代RG祖细胞的分离。专利技术概述多能干细胞在体外可以无限地增殖和扩充，从而提供潜在的无尽来源的非供体衍生的细胞用于人类治疗。多能干细胞分化成成熟RG细胞(包括均质的或接近均质的成熟RG细胞和/或早期和/或晚期RG祖细胞的群体，包括均质的或接近均质的RG祖细胞的群体)可以提供充足供应的非供体衍生的细胞，用于移植和治疗视网膜疾病或体外用途(例如筛选测试)。之前尚未获得高度纯化的成熟RG细胞的群体，并且之前也未获得足够数量或纯度的RG祖细胞的群体。本专利技术至少克服了这些现有技术方法和组合物中的这些限制。本专利技术尤其提供了包含RG祖细胞和/或成熟RG细胞的组合物或制备物，以及用于制备此类细胞和此类制备物的方法。惊人地发现，本专利技术的RG祖细胞和成熟RG细胞与原代神经节细胞相比，展现出更好的整合和迁移性质、以及更长的生存时间。在某些实施方案中，本专利技术提供了视网膜神经节(RG)祖细胞的基本纯的制备物，其包含多个RG祖细胞以及适于保持RG祖细胞的活力的培养基。此类培养基可以包含葡萄糖、胰岛素、增加cAMP水平的因子(例如毛喉素)、和神经营养因子(例如睫状神经营养因子(CNTF)和脑衍生的神经营养因子(BDNF))。在某些实施方案中，本专利技术提供了RG祖细胞的制备物，其包含多个细胞(其中包含至少50％的RG祖细胞)，以及适用于保持RG祖细胞的活力的培养基。在某些实施方案中，本专利技术提供了RG祖细胞的制备物，其包含多个RG祖细胞，该祖细胞基本上不具有不是RG祖细胞的细胞，例如多能干细胞、眼区祖细胞、光感受器祖细胞、成熟的光感受器和/或无长突细胞。在一些实施方案中，所述制备物中不是RG祖细胞的细胞少于10％，并且甚至更优选地少于5％,2％,1％,0.1％或者甚至少于0.01％。在一些实施方案中，所述制备物可以基本上不具有RG细胞(即，成熟RG细胞)。这些制备物的任意一种可以进一步包含适合于保持RG祖细胞的活力的培养基。在一些实施方案中，所述制备物可以包含成熟RG细胞和RG祖细胞的混合物，但是可以缺乏其他类型的细胞，例如多能干细胞,眼区祖细胞,光感受器祖细胞,成熟的光感受器和/或无长突细胞。在某些实施方案中，本专利技术提供了适合于哺乳动物患者使用的RG祖细胞的药物制备物，其包含多个RG祖细胞；以及适用于保持RG祖细胞被移植到哺乳动物患者中的活力的药物可接受载体。在某些实施方案中，本专利技术提供了低温细胞制备物，其包含至少109个RG祖细胞以及与RG祖细胞相容的并且能够保持此类细胞在解冻后的活力的低温保藏系统。在包含RG祖细胞的制备物的一些实施方案中，制备物中至少70％的细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)，并且甚至更优选地制备物中至少80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Brn3a(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Brn3b(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Isl1(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Brn3a(+)和Brn3b(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Brn3a(+),Brn3b(+)和Isl1(+)。在包含RG祖细胞的一些制备物中，制备物中至少70％的细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)和Brn3a(+)(即，是Math5和Brn3a阳性的)，甚至更优选地制备物中至少80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)和Brn3a(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Brn3b(+)。在一些实施方案中，制备物中至少50％,60％,70％,80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化学上是Math5(+),Brn3a(+)和Brn3b(+)。在一些实施方案中，制备物中的细胞还是Isl1(+)。在一些实施方案中，制备物中至少50％,60％,70％,80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化学上是Math5(+),Brn3a(+),Brn3b(+)和Isl(+)。在一些实施方案中，少于30％,20％,10％,5％,1％的细胞表达Thy1，或者所有细胞均不表达Thy1。RG祖细胞还可以表达Tuj1。在包含RG祖细胞的一些制备物中，制备物中至少50％,60％或70％的细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+)和/或神经丝(+)，甚至更优选地制备物中至少80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+)和/或神经丝(+)。在一些实施方案中，制备物中至少50％,60％或70％的细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+)和神经丝(+)，甚至更优选地制备物中至少80％,90％,95％或98％的细胞在免疫细胞化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RG祖细胞的基本纯的制备物，其包含：多个RG祖细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中在所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)，并且可任选地是Math5(+)和Brn3a(+)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.05 US 62/046,1651.一种RG祖细胞的基本纯的制备物，其包含：多个RG祖细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中在所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)，并且可任选地是Math5(+)和Brn3a(+)。2.一种RG祖细胞的基本纯的制备物，其包含：多个RG祖细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中在所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+)和神经丝(+)。3.一种RG祖细胞的制备物，其包含：多个细胞，其包含至少50％的RG祖细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中所述RG祖细胞在免疫细胞化学上是Math5(+),Brn3a(+),Brn3b(+)，并且可任选地是Isl1(+)。4.一种RG祖细胞的制备物，其包含：多个细胞，其包含至少50％的RG祖细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中所述RG祖细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+),神经丝(+)，并且可任选地是Thy1(+)。5.一种RG祖细胞的制备物，其包含：多个RG祖细胞，其基本不包含多能干细胞,成熟的光感受器和/或无长突细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中所述RG祖细胞在免疫细胞化学上是Math5(+),Brn3a(+),Brn3b(+)，并且可任选地是Isl1(+)。6.一种RG祖细胞的制备物，其包含：多个RG祖细胞，其基本不包含多能干细胞,成熟的光感受器和/或无长突细胞；以及适于保持所述RG祖细胞的活力的培养基，其中所述RG祖细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+),神经丝(+)，并且可任选地是Thy1(+)。7.一种适用于哺乳动物患者的RG祖细胞的药物制备物，其包含：(a)多个RG祖细胞，其中在所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)，并且可任选地是Math5(+)和Brn3a(+)；以及(b)药物可接受的载体，用于保持移植到哺乳动物患者中的所述RG祖细胞的活力。8.一种适用于哺乳动物患者的RG祖细胞的药物制备物，其包含：(a)多个RG祖细胞，其中在所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学上是Brn3a(+)和神经丝(+)；以及(b)药物可接受的载体，用于保持移植到哺乳动物患者中的所述RG祖细胞的活力。9.一种包含至少109个RG祖细胞的低温细胞制备物，其包含：(a)多个RG祖细胞，其中在所述制备物中超过90％的所述细胞在免疫细胞化学上是Math5(+)，并且可任选地是Math5(+)和Brn3a(+)；以及(b)低温保藏系统，其与解冻时所述RG祖细胞的活力相容。10.一种包含至少109个RG祖细胞的低温细胞制备物，其包...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪维，卢世江，R·P·兰扎，
申请(专利权)人：安斯泰来再生医药协会，
类型：发明
国别省市：美国,US