由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物技术

本发明专利技术提供了从多能干细胞例如人胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)制备血小板的方法。这些方法可在不形成拟胚体或多能干细胞簇的情况下进行，并且可以在不使用基质诱导细胞的情况下进行。另外，产量和/或纯度都比之前针对从多能干细胞制备血小板的方法报道的要高。还提供了包含血小板、优选地从多能干细胞制备的血小板的组合物和药物制剂。干细胞制备的血小板的组合物和药物制剂。干细胞制备的血小板的组合物和药物制剂。

【技术实现步骤摘要】
由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物
[0001]本申请是申请日为2013年12月21日、专利技术名称为“由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物”的中国专利技术专利申请NO. 201380073429.7的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2012年12月21日递交的、系列号为61/740,699的美国临时申请和2013年3月15日递交的、系列号为61/787,476的美国临时申请的权益，两件申请的专利技术名称都为“由多能干细胞制备血小板的方法及其组合物”，两件申请的内容在此整体引入作为参考。
[0004]专利技术背景
[0005]血小板是发挥重要和高度特异的血液凝固功能的微小血液细胞。一般人的血液中有几乎1兆血小板在循环，而血小板每10天就全部更换一次。这意味着血小板在进行着大量持续的生产。血小板有高度组织的细胞骨架，并且细胞内储存超过300种蛋白质，它们分泌在血管损伤部位。血小板也在炎症、血管生长和肿瘤转移中发挥作用。
[0006]血管损伤后，血小板迅速粘附于受损血管，并触发复杂的级联事件，导致血栓形成。在过去几十年间对血小板输注的需求不断增加(51)。用常规的方法，血小板只能存储不到一个星期，因而对依赖捐献的程序不断地产生挑战。血小板的供应短缺可具有潜在威胁生命的后果，尤其是对必须进行多次输血的患者。反复的输血也可能导致与免疫介导的宿主反应相关的耐受反应，并可能需要昂贵的患者配型(52，53)。能够在体外生成血小板，尤其是与患者匹配的血小板，在这些临床方案中具有显著的优势。
>[0007]对于具有不寻常/罕见血型的输血依赖患者，特别是那些同种异体免疫的患者，以及经常产生血小板同种异体免疫的癌症或白血病患者，血小板供应上的限制可能产生威胁生命的后果。因为输注的人血小板的半衰期为4
‑
5天，所以临床上必需对这些患者频繁输注血小板。此外，来自志愿捐献程序的血小板常常具有各种病原体污染的风险。血小板不能使用常规技术低温保存，因此能够体外生成血小板将为临床情况下的血小板替代疗法带来重大进展。
[0008]十几年来，对来自骨髓(BM)、脐带血(CB)或外周血(PB)的人类造血干细胞(HSC，CD34+)研究了巨核细胞(MK)和血小板生成。通过使用细胞因子、生长因子和/或基质饲养细胞的一定组合，由HSC制备功能性血小板已取得了重大成功(1；2)。然而，HSC仍需从献血者收集，并且在当前的培养条件下其扩增能力有限，这妨碍了大规模生产和未来的临床应用。
[0009]人类胚胎干细胞(hESC)可以体外无限繁殖和扩增，为人类治疗提供了可能取之不尽、用之不竭的无需献血者的细胞来源。在过去十年，对hESC向造血细胞的体外分化进行了广泛的研究。通过两种不同的培养体系，在体外成功地实现了hESC的定向造血分化。其中之一采用hESC 与基质饲养细胞在含血清培养基中共培养(3；4)。另一种方法采用在超低细胞结合培养板中存在细胞因子以及有/无血清的悬浮培养条件 (5
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7)；其终点是细胞聚集体或胚状体("EB")的形成。在上述两种分化的hESC培养体系中都发现了造血的前体，以及代表红系、粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞和淋巴系的成熟、功能性后代(3
‑
6:8
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14)。先前的研究还通过在血清存在下与基质细胞共培养从hESC产生了巨核细胞/血小板(15；16)。然而，巨核细胞/血小板在上述研究中的产率较低(15；16)。
[0010]专利技术概述
[0011]本专利技术提供了从多能干细胞制备血小板的方法，所述多能干细胞比如人胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞((iPSC或iPS细胞)，例如人类诱导的多能干细胞(hiPSC或hiPS细胞)。进行这些方法可能不产生胚状体，也可能无需使用基质诱导细胞。另外，产率和/或纯度可以高于之前报道的从多能干细胞制备血小板的方法。因为可以更高效和更大规模制备血小板，所以本专利技术的方法和组合物在医学输血应用中具有很大的潜力。另外，因为血小板不具有细胞核，并且只含有最低量的遗传物质，所以本专利技术的制剂可在输注前进行辐射以有效去除任何污染的有核细胞，比如未分化的hESC。因此，有核细胞的可能存在不会产生安全问题。
[0012]从献血者收集的血小板具有非常有限的有效期，而且患者的预防性输注对血小板的需求不断增长。与依赖献血者的脐带血或骨髓CD34+人造血干细胞不同，人胚胎干细胞(hESC)可以成为在可控条件下体外持续制备血小板的非常好的替代源。如这里进一步所述，本专利技术提供了在无血清和无基质的条件下从多能干细胞制备巨核细胞(MK)的体系和方法。在具体实施方案中，通过生血内皮细胞的分化(PVE
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HE，下面将进一步描述)使多能干细胞定向于巨核细胞。在PVE
‑
HE培养末期鉴定表达 CD31、CD144和CD105标志的瞬时多潜能细胞群。在无饲养细胞、无血清的悬浮培养中，存在TPO、SCF和其它细胞因子时，可以在18－20天内获得从hESC或hiPS细胞到MK的高达100倍的扩增。该方法可以由多能干细胞体外大量生成MK。在无饲养细胞的条件下培养时，多能干细胞产生的MK可以用来产生血小板样的颗粒(由人诱导的多能干细胞 (hiPSC
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PLT)或人胚胎干细胞(ES PLT)产生血小板或血小板样颗粒)。这些hiPSC
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PLT和ES
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PLT响应于凝血酶刺激并能参与微聚体形成。
[0013]一方面，本专利技术提供了适用于人类患者的药物制剂，其含有至少108的血小板。
[0014]另外，本专利技术提供了含有从人干细胞分化来的血小板的药物制剂，例如含有至少108个血小板。可选地，该制剂可基本上不含有白细胞。可选地，基本上所有的的血小板都可能是功能性的。
[0015]所述的药物制剂可含有109‑
10
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个血小板，可选地109、10
10
、10
11
、 10
12
、10
13
或10
14
个血小板。
[0016]血小板可具有一种或多种下列特性：平均血小板体积范围为 9.7
‑
12.8fL；制剂中大小的单峰分布；和/或血小板体积对数分布，其中一个标准差小于2μm3(优选小于1.5μm3、1μm3或甚至0.5μm3)。
[0017]血小板可能对至少一种下述标记呈阳性：CD41a和CD42b。
[0018]血小板可以是人类血小板。
[0019]至少50％、60％、70％、80％或90％的血小板是功能性的，并且可选地在室温保存至少2、3或4天后是功能性的。
[0020]另一方面，本专利技术提供了具有弱贴壁或非贴壁巨核细胞的生物反应器，其可在没有饲养细胞的情况下产生功能性血小板。
[0021]另一方面，本专利技术提供了含有至少109个巨核细胞系特异性前体 (MLP)的组合物。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.适用于人类患者的药物制剂，其包含至少108个血小板，其中所述的制剂基本上不含有白细胞，并且其中基本上所有的血小板都是有功能的。2.权利要求1的药物制剂，其包含109‑
10
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个血小板，任选109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
个血小板。3.权利要求1
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2任一项中的药物制剂，其中所述的血小板具有下述特性中的一个或多个：平均血小板体积范围为9.7
‑
12.8fL；所述的制剂中大小为单峰分布；和/或血小板体积对数分布...

【专利技术属性】
技术研发人员：Q，
申请(专利权)人：安斯泰来再生医药协会，
类型：发明
国别省市：