一种人血小板凋亡微囊泡的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用，并提供一种骨缺损修复制剂，包括PLGA支架材料，PLGA支架材料表面搭载前述人血小板凋亡微囊泡。本发明专利技术提供的来源于人血小板的凋亡微囊泡可从患者自身血液提取，避免了伦理问题和免疫问题。本发明专利技术提供的由PLGA/pDA支架搭载人血小板凋亡微囊泡构建的骨缺损修复制剂，改善了PLGA疏水、成骨活性低的缺点，特别是通过先在PLGA支架表面负载一层pDA膜后再搭载人血小板凋亡微囊泡，使得人血小板凋亡微囊泡能够在体内缓慢释放，进一步提高了间充质干细胞体内成骨能力。内成骨能力。内成骨能力。

【技术实现步骤摘要】
一种人血小板凋亡微囊泡的应用


[0001]本专利技术涉及生物组织工程
，具体为一种人血小板凋亡微囊泡的应用。

技术介绍

[0002]细胞凋亡是一个高度调控的细胞死亡过程，牺牲特定的细胞以获得更大的有机体利益。这是多细胞生物的正常生理过程。细胞凋亡以一种协调的方式赋予多细胞生物以优势，使其维持稳态并微调生命周期。细胞凋亡导致的死亡经历了几个阶段，首先是核染色质的凝结，接着是膜泡破裂，进而细胞内容物解体成不同的膜包裹的囊泡，称为凋亡小体或凋亡微囊泡(apoptotic vesicles，apoVs)。凋亡微囊泡不同于外泌体（又叫做外泌体微囊泡或外排体）、微囊泡（又叫做微泡）和逆转录病毒样颗粒 (Retrovirus
‑
Like Particles, RLPs)，外泌体、微囊泡和RLPs是在正常细胞过程中分泌的，而凋亡微囊泡仅在程序性细胞死亡过程中形成。细胞凋亡过程中，内容物聚合形成凋亡微囊泡并最终被吞噬细胞吞噬，这一过程被称为胞葬作用。传统观点认为胞葬作用是凋亡的终点，因此它在生物化学上结束了凋亡细胞的生命，而越来越多的证据表明，凋亡微囊泡中包装的物质在细胞之间存在转移、回收甚至再利用。
[0003]现有技术中通常从动物细胞或商品化细胞中获取凋亡微囊泡，但是从动物细胞中获取的凋亡微囊泡并非同源，应用于人体可能存在免疫排斥反应，且并不符合伦理要求；而商品化传代的MSCs通常不可避免地会经历表型、功能和更重要的基因变化，与原代细胞相比会导致不可预测的安全问题，其凋亡微囊泡的成骨潜能也会受到影响。目前血液是可从人体大量的、安全的、便捷的获取细胞的方式，使用同源血液来源的细胞产物可避免免疫排斥反应及传代带来的效果不稳定，更有利于未来临床应用。
[0004]骨组织缺损是骨科常见疾病之一，高能创伤和疾病、肿瘤切除、骨髓炎、发育畸形等是其常见病因。对于较小的骨缺损，人体可通过重塑自我修复，但较大的骨缺损预后往往较差，大面积缺损会引起骨的愈合不良、愈合畸形甚至病理性骨折。目前治疗骨缺损的金标准是自体骨移植，但移植物来源有限且供区易出现感染，限制了自体骨移植的大规模应用。而临床上骨移植需却求不断上涨，已成为第二常见的组织移植，频率仅次于输血。为解决自体骨短缺，多种修复材料被应用于骨缺损修复，如同种异体骨、异种骨、脱钙骨基质、生物陶瓷、金属支架、高分子支架材料等。其中合成高分子材料以其可加工的机械性能、高度可控的降解性能和均一一致的结构备受青睐，其中以聚乳酸
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羟基乙酸共聚化合物 (polylactic acid
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hydroxyacetic acid copolymer，PLGA) 应用最为广泛。然而，PLGA 支架材料表面疏水、成骨和成血管活性低等缺点限制其对大面积骨缺损的再生刺激。
[0005]为了改善上述缺点，研发一种来源于人的安全、有效的负载生物活性物质，加强PLGA成骨效果对骨缺损修复具有重大意义。

技术实现思路

[0006]针对现有骨缺损修复治疗方法存在的问题和效果不理想，本专利技术提供了一种安全
高效促进骨质再生的凋亡微囊泡，旨在解决现有骨缺损修复治疗效果并推进其治疗应用。
[0007]本专利技术提供了一种人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用。
[0008]其中，人血小板凋亡微囊泡的制备方法包括以下步骤：1）体外分离并提纯人血小板；2）以培养液重悬，加入星形孢菌素诱导血小板凋亡；3）收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡微囊泡。
[0009]具体的，a. 所述用于重悬的培养液为含有10%FBS和1%青
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链霉素双抗的MEMα培养基；b. 所述的梯度离心法包括以下步骤：1）将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；2）将所述第一离心上清液于4℃、以16000离心30min，取沉淀物，获得第二离心上清液；即得粗制凋亡微囊泡；3）将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得血小板凋亡微囊泡纯品；c. 所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为90
‑
300nm。
[0010]具体的，促进间充质干细胞成骨向分化的制剂可以为用于骨缺损修复的制剂。
[0011]本专利技术还提供一种骨缺损修复制剂，包括PLGA 支架材料，所述PLGA 支架材料表面搭载前述人血小板凋亡微囊泡。
[0012]具体的，所述的骨缺损修复制剂的构建过程包括以下步骤：（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。
[0013]具体的，1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中， 37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL，以10mM Tris
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HCl溶解，pH值为8.5；5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。
[0014]本专利技术还提供一种骨缺损修复制剂的制备方法，所述制备方法包括在PLGA 支架材料表面搭载前述人血小板凋亡微囊泡。
[0015]具体的，所述制备方法包括以下步骤：（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLGA /pDA支架；（3）将PLGA /pDA支架浸泡人血小板凋亡微囊泡溶液中。
[0016]更具体的，1）所述PLGA支架直径4 mm，高度2 mm；2）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中， 37℃振荡培养18 h，形成pDA膜；
3）在超声清洗机中用蒸馏水清洗去除未附着的多巴胺分子，直到水变清；75%乙醇灭菌1 h后，无菌PBS清洗3次；4）所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL，以10mM Tris
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HCl溶解，pH值为8.5；5）所述人血小板凋亡微囊泡溶液的浓度为0.5μg/μL。
[0017]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：本专利技术提供的来源于人血小板的凋亡微囊泡可从患者自身血液提取，避免了伦理问题和免疫问题，且本专利技术的凋亡微囊泡制备方法简单、成本低、产量高、可进行快速检测，体外使用凋亡微囊泡可促进人间充质干细胞成骨向分化。
[0018]本专利技术提供的由PLGA/pDA支架搭载人血小板凋亡微囊泡构建的骨缺损修复制剂，改善了PLGA疏水、成骨活性低的缺点，特别是通过先在PLGA支架表面负载一层pDA膜后再搭载人血小板凋亡微囊泡，使得人血小板凋亡微囊泡能够在体内缓慢释放，进一步提高了间充质干细胞体内成骨能力。经过动物体内实验验证，本专利技术的骨缺损修复制剂可显著提高间充质干细胞体内成骨能力，促进骨组织再生，无明显副作用，在治疗骨缺损修复领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人血小板凋亡微囊泡在制备促进间充质干细胞成骨向分化的制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人血小板凋亡微囊泡的制备方法包括以下步骤：1）体外分离并提纯人血小板；2）以培养液重悬，加入星形孢菌素诱导血小板凋亡；3）收集上清液，通过梯度离心法分离得到凋亡微囊泡。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下a
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c中的一项或多项：a. 所述用于重悬的培养液为含有10%FBS和1%青
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链霉素双抗的MEMα培养基；b. 所述的梯度离心法包括以下步骤：1）将所述上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；2）将所述第一离心上清液于4℃、以16000离心30min，取沉淀物，获得第二离心上清液；即得粗制凋亡微囊泡；3）将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得血小板凋亡微囊泡纯品；c. 所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为90
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300nm。4.根据权利要求1
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3任一项所述的应用，其特征在于，所述的制剂为用于骨缺损修复的制剂。5.一种骨缺损修复制剂，包括PLGA 支架材料,其特征在于,所述PLGA 支架材料表面搭载权利要求1
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4任一项中所述人血小板凋亡微囊泡。6.根据权利要求5所述的骨缺损修复制剂，其特征在于，所述的骨缺损修复制剂的构建过程包括以下步骤：（1）将PLGA支架浸泡在多巴胺溶液中形成pDA膜；（2）去除未附着的多余的多巴胺分子，得到PLG...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永胜，张晓，江雨荷，邵玉子，杨坤坤，
申请(专利权)人：北京大学口腔医学院，
类型：发明
国别省市：