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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及,具体为抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备及检验方法。
技术介绍
1、高血糖引起的勃起功能障碍除了因动脉血供减少引起外,海绵体平滑肌损失也是重要因素,临床实践表明,海绵体平滑肌病变导致的ed以pde5i类药物经常无效或疗效不佳,目前尚没有理想的治疗手段,严重者仅能通过阴茎假体植入疗法改善,且疗效有限,进一步增加了疾病的治疗难度和患者痛苦,间充质干细胞是具有广泛组织来源的、具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,既往很多研究表明干细胞移植到体内能趋化迁移至损伤组织,通过旁分泌作用调节免疫活性、抑制炎症反应、抑制凋亡,进而诱导机体固有修复活性起到治疗作用。
2、干细胞治疗高血糖具体的过程为,胰腺被膜下和尾静脉移植huc-mscs干预糖尿病,动物活体成像显示,胰腺被膜下移植huc-mscs主要定位于胰腺,而尾静脉移植主要定位于肺,胰腺被膜下途径改善糖代谢和胰岛功能优于尾静脉移植,另有研究显示,huc-mscs经两种途径移植,均能降低大鼠糖尿病的发生率,延缓发病,且胰腺被膜下移植组疗效更显著,通过尾静脉和病变局部两种方式移植huc-mscs改善大鼠糖尿病足发现,两种移植方式促进糖尿病足伤口愈合机制不同,尾静脉移植更有利于改善糖尿病整体代谢情况,较高剂量使溃疡愈合率也更高;且huc-mscs干预糖尿病,胰腺被膜下移植效果优于肾被膜下及肝实质移植。
3、但是,传统的干细胞移植治疗高血糖存在以下缺点:
4、传统的干细胞移植针对患者的糖代谢和胰岛功能进行修复,无法对高血糖对身
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备及检验方法,以解决上述
技术介绍
中提出的传统的干细胞移植针对患者的糖代谢和胰岛功能进行修复,无法对高血糖对身体产生的机能损伤进行修复,无法满足现阶段人们对高血糖的治疗期望的问题。
2、为实现上述目的,本专利技术提供如下技术方案:抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备方法,包括以下步骤:
3、步骤一、捐献者健康核查:捐献者接受严格的产前检查和病史调查,签署知情同意书;
4、步骤二、原材料准备:制备hucmsc使用商用无血清、无动物源成分的培养体系,所有辅料、耗材准备后均经过严格验证备用;
5、步骤三、输送脐带:胎儿娩出后采集脐带,经冷链运输配送至实验室;
6、步骤四、脐带处理:脐带经洗涤、分离得到华通氏胶,将华通氏胶剪碎成1-3mm3的组织块,接种至细胞培养瓶中;
7、步骤五、第一次培养:将接种后的细胞培养瓶放置于37℃,5%co2,饱和湿度条件下以原代干细胞完全培养基培养至第14天收获,记为p0代hucmsc;
8、步骤六、第二次培养:p0代细胞以传代干细胞完全培养基培养,传代至p4代收获;
9、步骤七、第三次培养:p4代hucmsc以注射用氯化钠溶液复配,即为所需bjzs001。
10、本专利技术抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法包括以下步骤:
11、步骤一、动物选取:选取69只spf级雄性sd大鼠,sd大鼠的生命周期≦5周,sd大鼠的体重80-100g;
12、步骤二、动物饲养:在温度22±2℃,湿度50%-60%,光照每12小时明暗交替,换风次数15-20次/小时的环境下饲养雄性sd大鼠;
13、步骤三、高血糖大鼠造模:69只spf级雄性sd大鼠作为造模组,均给予高脂饲料8周后,连续两周测随机血糖,均大于16.7mmol/l且不再下降即为高血糖大鼠;
14、步骤四、动物分组:造模10周时,随机抽取高血糖大鼠40只,分成4组,即低剂量组、中剂量组、高剂量组和阴性对照组;
15、步骤五、动物给药:大鼠仰卧位固定,戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉,以微量注射器延阴茎背侧面经海绵体注射给药,每侧40ul,双侧注射,其中,低剂量组给药0.72x106细胞/只,中剂量组给药2.25x106细胞/只,高剂量组给药0.72x107细胞/只,条件对照组和阴性对照组双侧海绵体给予80ul注射用氯化钠溶液为安慰剂;
16、步骤六、免疫荧光分析:p4代hucmsc收获后,以预冷的丙酮-乙醇固定液室温固定10min,pbs洗1次,加一抗,37℃孵育30min,pbs洗3次,加荧光标记二抗,37℃避光孵育30min,pbs洗5次,上机检测;
17、步骤七、hucmsc的体外分化潜能分析:对收获的p4代hucmsc分别进行成脂肪分化潜能分析、体外成骨分化潜能分析和成软骨分化潜能分析;
18、步骤八、组织取材:1bjzs001给药前1天和给药后8周时,大鼠沿阴茎白膜表面剥离阴茎,小心游离阴茎组织,取中段阴茎组织距离龟头4cm,包括阴茎海绵体组织和尿道海绵体组织,部分组织行石蜡包埋、切片,部分组织行组织匀浆待用;
19、步骤九、组织检测:对取材后的组织分别进行masson染色分析、免疫组织化学法和elisa检测;
20、步骤十、检测结果统计:采用spss25.0统计软件进行数据分析,计量资料若符合正态分布且符合方差齐性检验,用one-way-anova单因素方差分析,进一步组间两两比较采用lsd分析;若符合正态分布但方差不齐,则采用dunnett’s t3检验或独立样本t检验;若不符合正态分布,则采用kruskal-wallis h检验,所有数据以均值±标准差既±s表示,p<0.05为差异有统计学意义;
21、步骤十一、检测结果记录:p4代hucmsc多成长梭形,群落多成涡旋状生长,经免疫荧光检测高表达cd73、cd90、cd105,低表达cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr,具有成脂肪分化、成骨分化、成软骨分化潜能,符合isct于2006年对间充质干细胞的定义。
22、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周,其余4组继续行高脂饮食饲养8周。
23、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成脂诱导培养基,3-4天换液,培养10-20天时按油红o染色试剂盒染色,上镜观察。
24、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,70-80%以上汇合时,换成骨分化培养基,隔天换液,培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色,上镜观察。
25、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成软骨分化培养基,3-4天换本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于,包括以下步骤:
3.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周,其余4组继续行高脂饮食饲养8周。
4.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成脂诱导培养基,3-4天换液,培养10-20天时按油红O染色试剂盒染色,上镜观察。
5.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,70-80%以上汇合时,换成骨分化培养基,隔天换液,培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色,上镜观察。
...【技术特征摘要】
1.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于,包括以下步骤:
3.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周,其余4组继续行高脂饮食饲养8周。
4.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成脂诱导培养基,3-4天换液,培养10-20天时按油红o染色试剂盒染色,上镜观察。
5.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,70-80%以上汇合时,换成骨分化培养基,隔天换液,培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色,上镜观察。
6.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成软骨分化培养基,3-4天换液,培养14天,按阿尔新蓝染色试剂盒染色,上镜观察。
7.根据权利要求2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员:苑春慧,谢广宝,
申请(专利权)人:北京再生生物科技研究院有限公司,
类型:发明
国别省市:
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