System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001制备及检验方法技术_技高网

抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001制备及检验方法技术

技术编号:40135163 阅读:6 留言:0更新日期:2024-01-23 22:45
本发明专利技术公开了抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001制备及检验方法,包括以下步骤:步骤一、捐献者健康核查:捐献者接受严格的产前检查和病史调查,签署知情同意书;步骤二、原材料准备:制备hUCMSC使用商用无血清、无动物源成分的培养体系,所有辅料、耗材准备后均经过严格验证备用;步骤三、输送脐带:胎儿娩出后采集脐带,经冷链运输配送至实验室;步骤四、脐带处理:脐带经洗涤、分离得到华通氏胶,本发明专利技术以BJZS001经海绵体移植,能有效抑制高血糖引起的大鼠海绵体平滑肌凋亡,减少持续高血糖大鼠海绵体平滑肌损失,并有诱导海绵体平滑肌再生修复的潜能,因此BJZS001在开发高血糖引起的平滑肌损失的干预或治疗性药物方面有远大前途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及,具体为抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备及检验方法。


技术介绍

1、高血糖引起的勃起功能障碍除了因动脉血供减少引起外,海绵体平滑肌损失也是重要因素,临床实践表明,海绵体平滑肌病变导致的ed以pde5i类药物经常无效或疗效不佳,目前尚没有理想的治疗手段,严重者仅能通过阴茎假体植入疗法改善,且疗效有限,进一步增加了疾病的治疗难度和患者痛苦,间充质干细胞是具有广泛组织来源的、具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,既往很多研究表明干细胞移植到体内能趋化迁移至损伤组织,通过旁分泌作用调节免疫活性、抑制炎症反应、抑制凋亡,进而诱导机体固有修复活性起到治疗作用。

2、干细胞治疗高血糖具体的过程为,胰腺被膜下和尾静脉移植huc-mscs干预糖尿病,动物活体成像显示,胰腺被膜下移植huc-mscs主要定位于胰腺,而尾静脉移植主要定位于肺,胰腺被膜下途径改善糖代谢和胰岛功能优于尾静脉移植,另有研究显示,huc-mscs经两种途径移植,均能降低大鼠糖尿病的发生率,延缓发病,且胰腺被膜下移植组疗效更显著,通过尾静脉和病变局部两种方式移植huc-mscs改善大鼠糖尿病足发现,两种移植方式促进糖尿病足伤口愈合机制不同,尾静脉移植更有利于改善糖尿病整体代谢情况,较高剂量使溃疡愈合率也更高;且huc-mscs干预糖尿病,胰腺被膜下移植效果优于肾被膜下及肝实质移植。

3、但是,传统的干细胞移植治疗高血糖存在以下缺点:

4、传统的干细胞移植针对患者的糖代谢和胰岛功能进行修复,无法对高血糖对身体产生的机能损伤进行修复,无法满足现阶段人们对高血糖的治疗期望。


技术实现思路

1、本专利技术的目的在于提供抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备及检验方法,以解决上述
技术介绍
中提出的传统的干细胞移植针对患者的糖代谢和胰岛功能进行修复,无法对高血糖对身体产生的机能损伤进行修复,无法满足现阶段人们对高血糖的治疗期望的问题。

2、为实现上述目的,本专利技术提供如下技术方案:抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备方法,包括以下步骤:

3、步骤一、捐献者健康核查:捐献者接受严格的产前检查和病史调查,签署知情同意书;

4、步骤二、原材料准备:制备hucmsc使用商用无血清、无动物源成分的培养体系,所有辅料、耗材准备后均经过严格验证备用;

5、步骤三、输送脐带:胎儿娩出后采集脐带,经冷链运输配送至实验室;

6、步骤四、脐带处理:脐带经洗涤、分离得到华通氏胶,将华通氏胶剪碎成1-3mm3的组织块,接种至细胞培养瓶中;

7、步骤五、第一次培养:将接种后的细胞培养瓶放置于37℃,5%co2,饱和湿度条件下以原代干细胞完全培养基培养至第14天收获,记为p0代hucmsc;

8、步骤六、第二次培养:p0代细胞以传代干细胞完全培养基培养,传代至p4代收获;

9、步骤七、第三次培养:p4代hucmsc以注射用氯化钠溶液复配,即为所需bjzs001。

10、本专利技术抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法包括以下步骤:

11、步骤一、动物选取:选取69只spf级雄性sd大鼠,sd大鼠的生命周期≦5周,sd大鼠的体重80-100g;

12、步骤二、动物饲养:在温度22±2℃,湿度50%-60%,光照每12小时明暗交替,换风次数15-20次/小时的环境下饲养雄性sd大鼠;

13、步骤三、高血糖大鼠造模:69只spf级雄性sd大鼠作为造模组,均给予高脂饲料8周后,连续两周测随机血糖,均大于16.7mmol/l且不再下降即为高血糖大鼠;

14、步骤四、动物分组:造模10周时,随机抽取高血糖大鼠40只,分成4组,即低剂量组、中剂量组、高剂量组和阴性对照组;

15、步骤五、动物给药:大鼠仰卧位固定,戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉,以微量注射器延阴茎背侧面经海绵体注射给药,每侧40ul,双侧注射,其中,低剂量组给药0.72x106细胞/只,中剂量组给药2.25x106细胞/只,高剂量组给药0.72x107细胞/只,条件对照组和阴性对照组双侧海绵体给予80ul注射用氯化钠溶液为安慰剂;

16、步骤六、免疫荧光分析:p4代hucmsc收获后,以预冷的丙酮-乙醇固定液室温固定10min,pbs洗1次,加一抗,37℃孵育30min,pbs洗3次,加荧光标记二抗,37℃避光孵育30min,pbs洗5次,上机检测;

17、步骤七、hucmsc的体外分化潜能分析:对收获的p4代hucmsc分别进行成脂肪分化潜能分析、体外成骨分化潜能分析和成软骨分化潜能分析;

18、步骤八、组织取材:1bjzs001给药前1天和给药后8周时,大鼠沿阴茎白膜表面剥离阴茎,小心游离阴茎组织,取中段阴茎组织距离龟头4cm,包括阴茎海绵体组织和尿道海绵体组织,部分组织行石蜡包埋、切片,部分组织行组织匀浆待用;

19、步骤九、组织检测:对取材后的组织分别进行masson染色分析、免疫组织化学法和elisa检测;

20、步骤十、检测结果统计:采用spss25.0统计软件进行数据分析,计量资料若符合正态分布且符合方差齐性检验,用one-way-anova单因素方差分析,进一步组间两两比较采用lsd分析;若符合正态分布但方差不齐,则采用dunnett’s t3检验或独立样本t检验;若不符合正态分布,则采用kruskal-wallis h检验,所有数据以均值±标准差既±s表示,p<0.05为差异有统计学意义;

21、步骤十一、检测结果记录:p4代hucmsc多成长梭形,群落多成涡旋状生长,经免疫荧光检测高表达cd73、cd90、cd105,低表达cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr,具有成脂肪分化、成骨分化、成软骨分化潜能,符合isct于2006年对间充质干细胞的定义。

22、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周,其余4组继续行高脂饮食饲养8周。

23、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成脂诱导培养基,3-4天换液,培养10-20天时按油红o染色试剂盒染色,上镜观察。

24、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,70-80%以上汇合时,换成骨分化培养基,隔天换液,培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色,上镜观察。

25、作为本专利技术的一种优选技术方案,所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成软骨分化培养基,3-4天换本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

2.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于,包括以下步骤:

3.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周,其余4组继续行高脂饮食饲养8周。

4.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成脂诱导培养基,3-4天换液,培养10-20天时按油红O染色试剂盒染色,上镜观察。

5.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,70-80%以上汇合时,换成骨分化培养基,隔天换液,培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色,上镜观察。p>

6.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成软骨分化培养基,3-4天换液,培养14天,按阿尔新蓝染色试剂盒染色,上镜观察。

7.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤九Masson染色分析具体为石蜡切片经烘片、脱蜡至水,按masson染色试剂盒规定染色,简单说,酸性复红-丽春红液染色5min,磷钼酸液分化3min,苯胺蓝液染2min,脱水、透明、封片,上镜观察,胶原纤维、粘液、呈蓝色,肌纤维、纤维素及红细胞呈橙红色,以Image J管理系统采集和处理图像,测量出平滑肌既红色区域的面积。

8.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤九免疫组织化学法具体为石蜡切片经烘片、脱蜡至水,按一抗说明书规定染色,石蜡切片脱蜡至水,经抗原修复后,加一抗室温孵育1h,加HRP-IgG,山羊抗兔IgG H&LHRP预吸附二抗,ab97080,abcam,室温孵育30min,加DABBL732A,BIOSHAP显色,苏木素复染30s,盐酸酒精分化2s,自来水冲洗10min反蓝,脱水、透明、封片,上镜观察,黄色至棕色颗粒为阳性表达,细胞核呈蓝色至黑色,以Image-Pro Plus6.0管理系统采集和处理图像,进行半定量分析,用image pro plus 6.0图像分析系统测量出每个样本IOD值和Area值,200倍视野下样品面积,计算AOD值。

9.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法,其特征在于:所述步骤九中ELISA检测具体为以ELISA检测阴茎组织匀浆中AGEs,大鼠晚期糖基化终末产物含量。

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【技术特征摘要】

1.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

2.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于,包括以下步骤:

3.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周,其余4组继续行高脂饮食饲养8周。

4.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成脂诱导培养基,3-4天换液,培养10-20天时按油红o染色试剂盒染色,上镜观察。

5.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,70-80%以上汇合时,换成骨分化培养基,隔天换液,培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色,上镜观察。

6.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法,其特征在于:所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后,按5000细胞/cm2接种包被培养表面,90%以上融合时,换成软骨分化培养基,3-4天换液,培养14天,按阿尔新蓝染色试剂盒染色,上镜观察。

7.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员:苑春慧谢广宝
申请(专利权)人:北京再生生物科技研究院有限公司
类型:发明
国别省市:

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