【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体为抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备及检验方法。
技术介绍
1、高血糖引起的勃起功能障碍除了因动脉血供减少引起外，海绵体平滑肌损失也是重要因素，临床实践表明，海绵体平滑肌病变导致的ed以pde5i类药物经常无效或疗效不佳，目前尚没有理想的治疗手段，严重者仅能通过阴茎假体植入疗法改善，且疗效有限，进一步增加了疾病的治疗难度和患者痛苦，间充质干细胞是具有广泛组织来源的、具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，既往很多研究表明干细胞移植到体内能趋化迁移至损伤组织，通过旁分泌作用调节免疫活性、抑制炎症反应、抑制凋亡，进而诱导机体固有修复活性起到治疗作用。
2、干细胞治疗高血糖具体的过程为，胰腺被膜下和尾静脉移植huc-mscs干预糖尿病，动物活体成像显示，胰腺被膜下移植huc-mscs主要定位于胰腺，而尾静脉移植主要定位于肺，胰腺被膜下途径改善糖代谢和胰岛功能优于尾静脉移植，另有研究显示，huc-mscs经两种途径移植，均能降低大鼠糖尿病的发生率，延缓发病，且胰腺被膜下移植组疗效更显著，通过尾静脉和病变局部两种方式移植huc-mscs改善大鼠糖尿病足发现，两种移植方式促进糖尿病足伤口愈合机制不同，尾静脉移植更有利于改善糖尿病整体代谢情况，较高剂量使溃疡愈合率也更高；且huc-mscs干预糖尿病，胰腺被膜下移植效果优于肾被膜下及肝实质移植。
3、但是，传统的干细胞移植治疗高血糖存在以下缺点：
4、传统的干细胞移植针对患者的糖代谢和胰岛功能进行修复，无法对高血糖对身
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备及检验方法，以解决上述
技术介绍
中提出的传统的干细胞移植针对患者的糖代谢和胰岛功能进行修复，无法对高血糖对身体产生的机能损伤进行修复，无法满足现阶段人们对高血糖的治疗期望的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备方法，包括以下步骤：
3、步骤一、捐献者健康核查：捐献者接受严格的产前检查和病史调查，签署知情同意书；
4、步骤二、原材料准备：制备hucmsc使用商用无血清、无动物源成分的培养体系，所有辅料、耗材准备后均经过严格验证备用；
5、步骤三、输送脐带：胎儿娩出后采集脐带，经冷链运输配送至实验室；
6、步骤四、脐带处理：脐带经洗涤、分离得到华通氏胶，将华通氏胶剪碎成1-3mm3的组织块，接种至细胞培养瓶中；
7、步骤五、第一次培养：将接种后的细胞培养瓶放置于37℃，5％co2，饱和湿度条件下以原代干细胞完全培养基培养至第14天收获，记为p0代hucmsc；
8、步骤六、第二次培养：p0代细胞以传代干细胞完全培养基培养，传代至p4代收获；
9、步骤七、第三次培养：p4代hucmsc以注射用氯化钠溶液复配，即为所需bjzs001。
10、本专利技术抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法包括以下步骤：
11、步骤一、动物选取：选取69只spf级雄性sd大鼠，sd大鼠的生命周期≦5周，sd大鼠的体重80-100g；
12、步骤二、动物饲养：在温度22±2℃，湿度50％-60％，光照每12小时明暗交替，换风次数15-20次/小时的环境下饲养雄性sd大鼠；
13、步骤三、高血糖大鼠造模：69只spf级雄性sd大鼠作为造模组，均给予高脂饲料8周后，连续两周测随机血糖，均大于16.7mmol/l且不再下降即为高血糖大鼠；
14、步骤四、动物分组：造模10周时，随机抽取高血糖大鼠40只，分成4组，即低剂量组、中剂量组、高剂量组和阴性对照组；
15、步骤五、动物给药：大鼠仰卧位固定，戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉，以微量注射器延阴茎背侧面经海绵体注射给药，每侧40ul，双侧注射，其中，低剂量组给药0.72x106细胞/只，中剂量组给药2.25x106细胞/只，高剂量组给药0.72x107细胞/只，条件对照组和阴性对照组双侧海绵体给予80ul注射用氯化钠溶液为安慰剂；
16、步骤六、免疫荧光分析：p4代hucmsc收获后，以预冷的丙酮-乙醇固定液室温固定10min，pbs洗1次，加一抗，37℃孵育30min，pbs洗3次，加荧光标记二抗，37℃避光孵育30min，pbs洗5次，上机检测；
17、步骤七、hucmsc的体外分化潜能分析：对收获的p4代hucmsc分别进行成脂肪分化潜能分析、体外成骨分化潜能分析和成软骨分化潜能分析；
18、步骤八、组织取材：1bjzs001给药前1天和给药后8周时，大鼠沿阴茎白膜表面剥离阴茎，小心游离阴茎组织，取中段阴茎组织距离龟头4cm，包括阴茎海绵体组织和尿道海绵体组织，部分组织行石蜡包埋、切片，部分组织行组织匀浆待用；
19、步骤九、组织检测：对取材后的组织分别进行masson染色分析、免疫组织化学法和elisa检测；
20、步骤十、检测结果统计：采用spss25.0统计软件进行数据分析，计量资料若符合正态分布且符合方差齐性检验，用one-way-anova单因素方差分析，进一步组间两两比较采用lsd分析；若符合正态分布但方差不齐，则采用dunnett’s t3检验或独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用kruskal-wallis h检验，所有数据以均值±标准差既±s表示，p<0.05为差异有统计学意义；
21、步骤十一、检测结果记录：p4代hucmsc多成长梭形，群落多成涡旋状生长，经免疫荧光检测高表达cd73、cd90、cd105，低表达cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr，具有成脂肪分化、成骨分化、成软骨分化潜能，符合isct于2006年对间充质干细胞的定义。
22、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周，其余4组继续行高脂饮食饲养8周。
23、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，90％以上融合时，换成脂诱导培养基，3-4天换液，培养10-20天时按油红o染色试剂盒染色，上镜观察。
24、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，70-80％以上汇合时，换成骨分化培养基，隔天换液，培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色，上镜观察。
25、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，90％以上融合时，换成软骨分化培养基，3-4天换本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周，其余4组继续行高脂饮食饲养8周。
4.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，90％以上融合时，换成脂诱导培养基，3-4天换液，培养10-20天时按油红O染色试剂盒染色，上镜观察。
5.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，70-80％以上汇合时，换成骨分化培养基，隔天换液，培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色，上镜观察。p>
6.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为P4代hUCMSC收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，90％以上融合时，换成软骨分化培养基，3-4天换液，培养14天，按阿尔新蓝染色试剂盒染色，上镜观察。
7.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤九Masson染色分析具体为石蜡切片经烘片、脱蜡至水，按masson染色试剂盒规定染色，简单说，酸性复红-丽春红液染色5min，磷钼酸液分化3min，苯胺蓝液染2min，脱水、透明、封片，上镜观察，胶原纤维、粘液、呈蓝色，肌纤维、纤维素及红细胞呈橙红色，以Image J管理系统采集和处理图像，测量出平滑肌既红色区域的面积。
8.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤九免疫组织化学法具体为石蜡切片经烘片、脱蜡至水，按一抗说明书规定染色，石蜡切片脱蜡至水，经抗原修复后，加一抗室温孵育1h，加HRP-IgG，山羊抗兔IgG H&LHRP预吸附二抗，ab97080，abcam，室温孵育30min，加DABBL732A，BIOSHAP显色，苏木素复染30s，盐酸酒精分化2s，自来水冲洗10min反蓝，脱水、透明、封片，上镜观察，黄色至棕色颗粒为阳性表达，细胞核呈蓝色至黑色，以Image-Pro Plus6.0管理系统采集和处理图像，进行半定量分析，用image pro plus 6.0图像分析系统测量出每个样本IOD值和Area值，200倍视野下样品面积，计算AOD值。
9.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的BJZS001检验方法，其特征在于：所述步骤九中ELISA检测具体为以ELISA检测阴茎组织匀浆中AGEs，大鼠晚期糖基化终末产物含量。
...【技术特征摘要】
1.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法，其特征在于：所述步骤五中条件对照组大鼠继续常规饲养8周，其余4组继续行高脂饮食饲养8周。
4.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法，其特征在于：所述步骤七中成脂肪分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，90％以上融合时，换成脂诱导培养基，3-4天换液，培养10-20天时按油红o染色试剂盒染色，上镜观察。
5.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法，其特征在于：所述步骤七中体外成骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，70-80％以上汇合时，换成骨分化培养基，隔天换液，培养12-18天按茜素红染色试剂盒染色，上镜观察。
6.根据权利要求2所述的抑制高血糖引起海绵体平滑肌凋亡的bjzs001检验方法，其特征在于：所述步骤七中成软骨分化潜能分析具体为p4代hucmsc收获后，按5000细胞/cm2接种包被培养表面，90％以上融合时，换成软骨分化培养基，3-4天换液，培养14天，按阿尔新蓝染色试剂盒染色，上镜观察。
7.根据权利要求2所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：苑春慧，谢广宝，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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