【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体为一种hucmsc/svf-pep@gel的制备及用途。
技术介绍
1、骨关节炎是由多种因素引起的关节退行性疾病，病理特点包括关节软骨变性破坏、滑膜炎、软骨下骨硬化或囊性变、关节边缘骨质增生、骨赘形成等症状，骨关节炎的发病与年龄、创伤、炎症、肥胖、劳损等诸多因素有关，随着人口的老龄化加剧和肥胖人群比例的增多，oa的发病率不断升高，65岁以上年龄段的发病率高达80％，oa已成为第四大致残性疾病，oa不仅会严重影响患者的生活质量，还会给患者家庭及社会带来严重的经济负担。目前oa的主流治疗包括非药物、药物和手术方法。
2、间充质干细胞疗法在oa的治疗中已显示出良好的应用前景。人脐带间充质干细胞是来源于人脐带华通氏胶组织的成体干细胞，来源广泛，增殖能力强，是公认的最具有成药潜能的msc类型，在软骨组织工程领域得到广泛关注，hucmsc在oa治疗中的前景广大。
3、注射原位凝胶形成系统在生理条件下表现出从溶液、溶胶到凝胶的相变，产生能够提供包封药物的局部释放的贮库，在糖尿病、伤口愈合和脊髓损伤等适应症的治疗中得到广泛应用，msc-相变水凝胶制备和应用也有文献报道，对于保持msc活性和移植的长期存活有益，脂肪血管基质成分是脂肪组织中一团富含前体脂肪细胞、骨髓基质细胞、内皮祖细胞、t细胞、b细胞、肥大细胞和脂肪组织巨噬细胞的细胞集群组织，svf与msc共移植延长了msc存活期对于msc药物开发意义重大。
4、但是，传统的骨关节炎治疗存在以下缺点：
5、传统的骨关节炎干
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种hucmsc/svf-pep@gel的制备及用途，以解决上述
技术介绍
中提出的传统的骨关节炎干预措施只能提供短暂的症状缓解，例如短期疼痛缓解，但对停止或减缓oa发展没有作用，目前的治疗方式主要是早期口服药物或者关节腔注射玻璃酸钠，实现短期内缓解症状的疗效；中晚期采取微骨折术、软骨移植术、关节置换术等手术治疗，但存在着软骨来源少、再生能力差、术后活动严重受限等诸多缺点，目前尚无有效药物及手段预防和从病理上逆转疾病发展来治疗骨关节炎的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种hucmsc/svf-pep@gel的制备，包括以下步骤：
3、步骤一、hucmsc的分离培养：以组织块法培养p0 hucmsc，加入0.25％胰蛋白酶溶液和1ml抑肽酶溶液，消化，收获沉淀物、沉淀细胞，接种培养备用；
4、步骤二、svf的提取培养：将脂肪抽吸术得到的60ml脂肪组织以无菌pbs反复冲洗2-3遍至洗液清亮，加入等体积的0.075％i型胶原酶，置于37℃恒温摇床震荡消化约40分钟，以60目细胞筛过滤，收集滤液，400×g离心10分钟，吸除油脂层和乳状细胞层，在小心吸弃澄清上清，以0.9％氯化钠注射液重悬成6ml细胞悬液，即为svf原液；
5、步骤三、x hucmsc、2x hucmsc/svf悬液制备：取4×106/ml的hucmsc悬液5ml，加入5ml 0.9％氯化钠注射液，制成2x hucmsc备用；取4×106/ml的hucmsc悬液5ml，加入5mlsvf原液，制成2x hucmsc/svf悬液含2×106/ml hucmsc备用；
6、步骤四、制备hucmsc、hucmsc/svf-pep@gel：将50g plga1500-peg1200-plga1500在4℃条件下使用低温涡旋搅拌均匀，分散溶解于100g纯水中，制成体积分数为50％的pep@gel，然后将纯水、2x hucmsc或2x hucmsc/svf悬液10ml分别加入到10ml质量分数50％的pep@gel中，混合均匀，制备成质量分数为25％的pep@gel，或含终浓度为1×106/ml hucmsc的hucmsc-pep@gel和hucmsc/svf-pep@gel，4-8℃条件下，将pep@gel、hucmsc-pep@gel、hucmsc/svf-pep@gel分别灌注至24孔板中，0.5ml/孔，置于37℃促凝；
7、步骤五、多方位检测鉴定：分别对hucmsc-pep@gel、hucmsc/sv-pep@gel进行相变温度测定、hucmsc存活情况检查、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gelⅱ型胶原沉积检查、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel的成骨、成脂、成软骨分化潜能分析、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel分泌效应。
8、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤一中培养体系为msc完全培养基dmem/f1212400-024，gibco，10％无动物源成分血清替代品c08003c，stemboscience，所述步骤一中加入0.25％胰蛋白酶溶液和1ml抑肽酶溶液具体为培养至12天时，轻轻震荡培养瓶，悬浮残余组织块，小心吸弃培养上清，pbs洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液t6424-1vl，biological industries，室温消化5分钟，加入1ml抑肽酶溶液1a1250000，sigma终止消化，所述步骤一中收获沉淀物具体为400×g离心5分钟，弃上清，收获沉淀物；以pbs洗涤2次，以100μm尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400×g离心5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为p0代hucmsc，所述步骤一中接种培养备用具体为p0代hucmsc以msc完全培养基重悬，按6×103/cm2接种至175cm2组织培养瓶easyflask，nunc，培养至70-80％汇合时收获p1代hucmsc；p1代hucmsc继续传代至p4，p4 hucmsc以0.9％氯化钠注射液重悬，调整细胞浓度至4×106/ml，备用。
9、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤五中hucmsc-pep@gel、hucmsc/sv-pep@gel相变温度测定具体为：同法制备质量分数20％、26％、32％、38％、44％、50％的pep@gel，分别加入等体积的纯水、2x hucmsc或2x hucmsc/svf悬液，混合均匀，制成质量分数为10％、13％、16％、19％、22％和25％的pep@gel、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel，在恒温水浴中从20℃加热至65℃，测定pep@gel、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel的溶液-凝胶-沉淀的相变温度，并绘制了相变图，随后以rh-20流变仪测定体积分数为2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种hUCMSC/SVF-PEP@Gel的制备，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种hUCMSC/SVF-PEP@Gel的制备，其特征在于：所述步骤一中培养体系为MSC完全培养基DMEM/F1212400-024，GIBCO，10％无动物源成分血清替代品C08003C，Stemboscience，所述步骤一中加入0.25％胰蛋白酶溶液和1mL抑肽酶溶液具体为培养至12天时，轻轻震荡培养瓶，悬浮残余组织块，小心吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液T6424-1VL，Biological industries，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液1A1250000，Sigma终止消化，所述步骤一中收获沉淀物具体为400×g离心5分钟，弃上清，收获沉淀物；以PBS洗涤2次，以100μm尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400×g离心5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代hUCMSC，所述步骤一中接种培养备用具体为P0代hUCMSC以MSC完全培养基重悬，按6×103/cm2接种至175cm2组织培养瓶EasyFlask，NUNC
3.根据权利要求1所述的一种hUCMSC/SVF-PEP@Gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hUCMSC-PEP@Gel、hUCMSC/SV-PEP@Gel相变温度测定具体为：同法制备质量分数20％、26％、32％、38％、44％、50％的PEP@Gel，分别加入等体积的纯水、2X hUCMSC或2X hUCMSC/SVF悬液，混合均匀，制成质量分数为10％、13％、16％、19％、22％和25％的PEP@Gel、hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel，在恒温水浴中从20℃加热至65℃，测定PEP@Gel、hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel的溶液-凝胶-沉淀的相变温度，并绘制了相变图，随后以RH-20流变仪测定体积分数为25％的PEP@Gel、hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel的弹性模量G′和粘性模量G″，确定凝胶化温度。
4.根据权利要求1所述的一种hUCMSC/SVF-PEP@Gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hUCMSC存活情况检查具体为：将凝胶化的hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel置于6孔板中，加入37℃预温的0.9％氯化钠注射液1.5ml，于37℃、5％CO2条件下培养，隔天换液，D0、D3、D7、D14、D30时，hUCMSC-PEP@Gel和hUCMSC/SVF-PEP@Gel培养组吸弃培养上清，于4-8℃静置30分钟，再转移至37℃、5％CO2条件下孵育1小时，3组样品以死活细胞双染试剂盒染色30分钟，吸弃染液，以0.9％氯化钠注射液漂洗3次，倒置荧光显微镜下观察，绿色为活细胞，红色为死细胞。
5.根据权利要求1所述的一种hUCMSC/SVF-PEP@Gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@GelⅡ型胶原沉积检查具体为：将凝胶化的hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel置于6孔板中，加入37℃预温的MSC完全培养基1.5ml，于37℃、5％CO2条件下培养，隔天换液，D0、D3、D7、D14、D30时，吸弃培养上清，于4-8℃静置30分钟，再转移至37℃、5％CO2条件下孵育1小时后，吸弃培养上清，以4％多聚甲醛固定1小时，随后以4℃预冷的PBS洗涤3次0.1％Triton X-100室温对细胞进行透化20min，用体积分数10％山羊血清对细胞进行封闭30分钟；加入免抗人一抗4℃下孵育过夜，加入山羊抗免IgGH&L FITC，37℃孵育1小时，以PBS洗涤3次后，倒置荧光显微镜下观察，绿色荧光代表Ⅱ型胶原染色阳性。
6.根据权利要求1所述的一种hUCMSC/SVF-PEP@Gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel的成骨、成脂、成软骨分化潜能具体为：将凝胶化的hUCMSC-PEP@Gel或hUCMSC/SVF-PEP@Gel置于6孔板中，于4-8℃静置30分钟，再转置37℃、5％CO2，饱和湿度条件下孵育1小时，加入MSC完全培养基1.5ml/孔，于37℃、5％CO2，饱和湿度条件下培养24小时，按成骨分化试剂盒、成脂分化试剂盒，成软骨...
【技术特征摘要】
1.一种hucmsc/svf-pep@gel的制备，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种hucmsc/svf-pep@gel的制备，其特征在于：所述步骤一中培养体系为msc完全培养基dmem/f1212400-024，gibco，10％无动物源成分血清替代品c08003c，stemboscience，所述步骤一中加入0.25％胰蛋白酶溶液和1ml抑肽酶溶液具体为培养至12天时，轻轻震荡培养瓶，悬浮残余组织块，小心吸弃培养上清，pbs洗涤培养表面1次，加入0.25％胰蛋白酶溶液t6424-1vl，biological industries，室温消化5分钟，加入1ml抑肽酶溶液1a1250000，sigma终止消化，所述步骤一中收获沉淀物具体为400×g离心5分钟，弃上清，收获沉淀物；以pbs洗涤2次，以100μm尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400×g离心5分钟，弃上清，收获沉淀细胞，记为p0代hucmsc，所述步骤一中接种培养备用具体为p0代hucmsc以msc完全培养基重悬，按6×103/cm2接种至175cm2组织培养瓶easyflask，nunc，培养至70-80％汇合时收获p1代hucmsc；p1代hucmsc继续传代至p4，p4 hucmsc以0.9％氯化钠注射液重悬，调整细胞浓度至4×106/ml，备用。
3.根据权利要求1所述的一种hucmsc/svf-pep@gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hucmsc-pep@gel、hucmsc/sv-pep@gel相变温度测定具体为：同法制备质量分数20％、26％、32％、38％、44％、50％的pep@gel，分别加入等体积的纯水、2x hucmsc或2x hucmsc/svf悬液，混合均匀，制成质量分数为10％、13％、16％、19％、22％和25％的pep@gel、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel，在恒温水浴中从20℃加热至65℃，测定pep@gel、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel的溶液-凝胶-沉淀的相变温度，并绘制了相变图，随后以rh-20流变仪测定体积分数为25％的pep@gel、hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel的弹性模量g′和粘性模量g″，确定凝胶化温度。
4.根据权利要求1所述的一种hucmsc/svf-pep@gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hucmsc存活情况检查具体为：将凝胶化的hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gel置于6孔板中，加入37℃预温的0.9％氯化钠注射液1.5ml，于37℃、5％co2条件下培养，隔天换液，d0、d3、d7、d14、d30时，hucmsc-pep@gel和hucmsc/svf-pep@gel培养组吸弃培养上清，于4-8℃静置30分钟，再转移至37℃、5％co2条件下孵育1小时，3组样品以死活细胞双染试剂盒染色30分钟，吸弃染液，以0.9％氯化钠注射液漂洗3次，倒置荧光显微镜下观察，绿色为活细胞，红色为死细胞。
5.根据权利要求1所述的一种hucmsc/svf-pep@gel的制备，其特征在于：所述步骤五中hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@gelⅱ型胶原沉积检查具体为：将凝胶化的hucmsc-pep@gel或hucmsc/svf-pep@...
【专利技术属性】
技术研发人员：苑春慧，谢广宝，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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