一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，包括如下步骤：S1.将新生儿脐带无菌采集；S2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；S3.将脐带样本洗净，消毒，生理盐水漂洗；S4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，漂洗；S5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，加入2XDMEM（L）混匀；S6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中，4℃冰箱中过夜后，加入完全培养基，置于CO2培养箱内至细胞长满凝胶层；S7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得P0代MSCs，P0代MSCs冻存，即为脐带源MSCs主细胞库。

Preparation method of perinatal umbilical cord source mesenchymal stem cell master cell bank

The invention discloses a preparation method of perinatal umbilical cord derived mesenchymal stem cells of the master cell bank, which comprises the following steps: S1. S2. of neonatal umbilical cord were collected; screening of pathogenic microorganisms on maternal, aseptic testing of umbilical cord samples; S3. umbilical cord samples washed, sterilized, saline rinse with S4.; saline perfusion, residual blood samples of umbilical cord extrusion, will cut into tissue, rinse with deionized water; S5. gelatin solution, sterilization, cooling, adding 2XDMEM (L) blending; S6. tissue blocks, adding gelatin solution and transferred to tissue culture flasks, 4 C in the refrigerator overnight after joining the medium is placed in the CO2 incubator to cell with gel layer; S7. harvest by trypsin digestion. The cells were harvested by centrifugation and filtration sieve cell P0 MSCs, P0 MSCs is frozen Cord source MSCs main cell bank.

【技术实现步骤摘要】
一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法
本专利技术涉及细胞库的制备方法，具体来说，涉及一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法。
技术介绍
间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，是最重要的工程种子细胞之一，可以体外大规模培养而不丧失自我更新和多向分化潜能，在药物研发、再生医学和组织工程、基因工程等领域有广阔的应用前景。2012年，Osiris公司研发的用于治疗儿童急性移植物抗宿主病的PROCHYMAL在加拿大、新西兰获得上市批准，成为干细胞再生医学发展史上的标志性事件。随后，Hearticellgram-AMI、Cupistem、Cartistem、Osteocel、Trinity、LiquidGen等MSCs产品或组织工程产品获批，细胞治疗的临床应用已经进入成熟期。近些年来发现，围产期新生儿附属物，包括胎盘、羊膜、脐带中含有丰富的MSCs，是最适于建立MSCs生物样本库的样本资源。虽然MSC的分离、培养方法不断改进，但满足细胞库存储的细胞得率仍旧不高。我们的调查发现，个体脐带MSCs存储的合同约定存储量为P2代MSCs1X108。按照静脉输入P3代细胞剂量1X108/疗程，大约够10个疗程，无法满足“干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)”的内部质控和质量复核的细胞量要求，因此目前的MSCs库依旧是个体化治疗库，无法满足配型库制备主细胞库、工作细胞库的细胞量需求，究其原因主要是原代培养工艺落后导致原代细胞得率低造成的。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种围产期脐带源MSCs主细胞库的制备方法，能够提高P0代MSCs得率，满足配型库的质控细胞量和移植细胞量要求。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种围产期脐带源间MSCs主细胞库的制备方法，包括如下步骤：S1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集；S2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；S3.将脐带样本在生理盐水中洗净残血，用消毒酒精浸泡，再经生理盐水漂洗两次；S4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，用生理盐水漂洗3次；S5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，缓慢加入2XDMEM（L），水浴摇床混匀；S6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，向培养瓶中加入完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱内培养，至细胞长满凝胶层时收获；S7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得P0代MSCs，P0代MSCs冻存，记为脐带源MSCs主细胞库。进一步地，所述步骤S1中新生儿脐带进行无菌采集长度为15-20cm，两端结扎，所述步骤S3中经生理盐水漂洗两次后，需要在结扎处剪断，弃去两端。进一步地，所述步骤S3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。进一步地，所述步骤S2中产妇经病原微生物筛查，应无HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、TP感染，脐带样本浸泡在生理盐水中，采集残血血样进行无菌检测，结果应为阴性，进行支原体检测，结果应为阴性。进一步地，所述步骤S5中，所用明胶为24g，以55℃100mL去离子水溶解，116℃条件下湿热灭菌15分钟,冷却至40℃，缓慢加入预温至40℃的100mL2XDMEM（L）中，水浴摇床混匀。进一步地，所述DMEM（L）含有4%的UltroserGserumsubstitute，所述DMEM（L）中rhb-FGF的浓度为50ng/mL。进一步地，所述步骤S6中，取2cm脐带样品的组织块，加入15ml明胶溶液，搅拌混匀，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，每个培养瓶中缓慢加入15ml完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱内培养，每3天观察，每7天换液，至细胞长满凝胶层时收获。进一步地，步骤S6中所述的完全培养基为DMEM（L），所述完全培养基含有40%的MCDB201、1%的ITS、2%的FBS，所述完全培养基中地塞米松浓度为50nmol/L，抗坏血酸浓度为0.1mmol/L，rhLIF浓度为103U/mL，rhPDGF-b浓度为10ng/mL，rhEGF浓度为10ng/mL。进一步地，所述步骤S7中，收获细胞时，小心吸弃培养上清，加入5mL含0.08%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液，震荡混匀，室温消化10min；加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；记为P0代；P0代细胞冻存，即为脐带源MSCs主细胞库。本专利技术的有益效果：使用本专利技术所述的围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，MSCs主细胞库（P0代）得率高达5X107，MSCs工作细胞库（P3代）得率不少于6.5X109，除去1.5X109内部质量控制和质量复核的细胞量，至少够50个疗程的细胞输入治疗剂量，完全满足配型库的质控细胞量和移植细胞量要求。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是根据本专利技术实施例所述的10cm脐带采用不同培养方法的MSCs收率；图2是根据本专利技术实施例所述的对照组和半固体培养组之间的P3代生长曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的器材和试剂均为本领域常用试剂，可从商业途径获得。首先，对本申请中出现的英文名称及实施例中所具体使用的各种产品的生产厂家、货号进行简要说明。MSCs：Mesenchymalstemcells，间充质干细胞。HIV：艾滋病毒。HBV：乙型肝炎病毒。HCV：丙型肝炎病毒。HTLV：人类嗜T细胞病毒。EBV：人类疱疹病毒。CMV：巨细胞病毒。TP：梅毒螺旋体。Wharton’s胶：是一根条索样的带状物，表面为羊膜所覆盖，呈白色，表面光滑、湿润，直径约1-2.5cm，脐带内有两条动脉和一条静脉，Wharton’s胶即血管周围半透明的基质。DMEM(L)：即lowdulbecco'smodifiedeaglemedium，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。本实施例中所使用的DMEM(L)品牌为invitrogen，货号为12800017。UltroserGserumsubstitute：是一种血清替代物。本实施例中所使用的UltroserGserumsubstitute品牌为PALL，货号为15950-017。rhb-FGF：重组人碱性成纤维细胞生长因子。本实施例中所使用的rhb-FGF品牌为PeproTech，货号为GMP100-18B。MCDB201：一种用于成纤维样细胞的低血清或无血清培养基。本实施例中所使用的MCDB201品牌为Sigma，货号为M6770。ITS:是一种细胞培养添加物，成分包括了三种最常用的添加物，胰岛素(Iusulin)、人转铁蛋白(humantransferrin)、亚硒酸(selenousacid)。本实施例中所使用的ITS品牌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集；S2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；S3.将脐带样本在生理盐水中洗净残血，用消毒酒精浸泡，再经生理盐水漂洗两次；S4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，用生理盐水漂洗3次；S5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，缓慢加入2XDMEM（L），水浴摇床混匀；S6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，向培养瓶中加入完全培养基，置于37℃，5% CO2培养箱内培养，至细胞长满凝胶层时收获；S7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得P0代MSCs，P0代MSCs冻存，即为脐带源MSCs主细胞库。

【技术特征摘要】
1.一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集；S2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；S3.将脐带样本在生理盐水中洗净残血，用消毒酒精浸泡，再经生理盐水漂洗两次；S4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，用生理盐水漂洗3次；S5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，缓慢加入2XDMEM（L），水浴摇床混匀；S6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，向培养瓶中加入完全培养基，置于37℃，5%CO2培养箱内培养，至细胞长满凝胶层时收获；S7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得P0代MSCs，P0代MSCs冻存，即为脐带源MSCs主细胞库。2.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中新生儿脐带进行无菌采集长度为15-20cm，两端结扎，所述步骤S3中经生理盐水漂洗两次后，需要在结扎处剪断，弃去两端。3.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。4.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中产妇经病原微生物筛查，应无HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、TP感染，脐带样本浸泡在生理盐水中，采集残血血样进行无菌检测，结果应为阴性，进行支原体检测，结果应为阴性。5.根据权利要求1所述的一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，所用明胶为24g，以55℃100mL去离子水溶解，116℃条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪钿，苑春慧，
申请(专利权)人：北京再生生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11