一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基技术

本发明专利技术公开一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基，该优化培养基包括DMEM培养基、F‑12Nutirient Mix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂。本发明专利技术利用优化的培养基培养人气道上皮细胞的方法，不仅大大的简化了需要3T3 J2细胞为饲养层而培养上皮细胞的步骤，只需要将链霉蛋白酶消化的原代人气道上皮细胞培养于本发明专利技术优化的培养基中，且获得了快速分离且无限传代培养的人气道上皮细胞，将传代培养的人气道上皮细胞进行体外扩增培养，达到20代以上，即可获得足够量的种子细胞用于如体外细胞互作模型研究等诸多后续的体内外研究中。

A rapid method for isolation and culture of human airway epithelial cells and optimization of culture medium

The present invention discloses a method and an optimized medium for rapid isolation and culture of human airway epithelial cells. The optimized medium includes DMEM medium, F 12Nutirient Mix medium, 0.5mg/ml hydrogenated cortisone, fetal bovine serum, 25ug/ml epidermal growth factor, 5mg/ml insulin, cholera toxin of 11.7uM, ROCK1 inhibition of 10mM. Preparation and BMP4 antagonist of 10mM. The method of cultivating human airway epithelial cells by the optimized medium not only greatly simplifies the steps that the 3T3 J2 cells are needed to cultivate the epithelial cells, but only the primary human airway epithelial cells digested by the streptomycin can be cultured in the optimized culture medium, and the rapid separation and infinity are obtained. Human airway epithelial cells are cultured in vitro, and the cultured human airway epithelial cells are amplified and cultured in vitro, reaching more than 20 generations. Enough seed cells can be used to study in vitro and in vivo studies, such as in vitro cell interaction model.

【技术实现步骤摘要】
一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基
：本专利技术属于原代细胞分离培养
，具体涉及一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法及优化培养基。
技术介绍
：人的气道主要是由基底细胞、杯状细胞、纤毛细胞等三种上皮细胞组成的假复层上皮，其中基地细胞排列在基底膜，是目前公认认的气道上皮干细胞，杯状细胞产生粘液以捕获吸入的颗粒和病原体，而纤毛细胞产生运动力将其从肺部移除。气管移植后，粘液纤毛清除受损是一个重要的挑战，因为分泌物保留在远端吻合部位。气道上皮细胞的体外培养增殖是气道上皮功能和再生医学研究的基础，但目前细胞的分离方法和培养条件都无法满足实际研究需求，而从支气管内活检获得且在无血清支气管上皮生长培养基(BEGM)中培养而获得足够数量的自体上皮细胞存在很大的挑战。这是扩增基地细胞进行体外研究的有用工具，但是我们发现它不适合上皮细胞生物学和组织再生工程的研究，因为培养失败，生长的细胞不能提供足够的细胞数量用于移植物覆盖。另外，在BEGM中，通过在一次或两次传代后，自我更新能力开始在培养物中丧失。因此，用BEGM培养人气道上皮细胞不能过获得足够数量的用于组织工程气管移植。目前，有研究通过与有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞共培养，实现人体表皮干细胞的体外长期扩增，即Rho相关蛋白激酶(ROCK)的抑制增加增殖并有条件地使细胞永生化，从而允许干细胞的无限繁殖以及组织适当的分化能力。但其操作复杂、繁琐，原代细胞培养过程中细胞状态受到丝裂霉素C处理3T3J2细胞的影响较大。因此，寻求简单且有效的人气道上皮细胞培养的方法与培养基对获得足够量的上皮细胞尤为重要。
技术实现思路
：本专利技术的目的旨在提供一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种培养人气道上皮细胞的优化培养基。为达到上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法，包括如下步骤：1)清洗人支气管或细支气管：取离体的肺脏组织，去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结蹄组织后，用无菌的剪刀剪成块状于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，备用；步骤1)中所述PBS缓冲液为预冷无菌的含有1％双抗和2.5μg/ml两性霉素B的溶液。2)分离人气道上皮细胞：将清洗好的组织块置于冻存管中，加入预先配置好的消化液，在37℃条件下旋转消化40-60min后，待气管变软后且有细胞团块或单细胞时，将冻存管中的消化液和组织块一起转移至离心管中，加入胎牛血清(FBS)至终浓度为5％，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化；步骤2)中所述预先配置好的消化液是由DMEM培养基、1％双抗、2.5μg/ml两性霉素B和15mg/mL链霉蛋白酶(pronese)配制而成的。3)收集人气道上皮细胞：将消化好的人气道上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行悬浮；4)去除成纤维细胞：将重悬的细胞接种到细胞培养皿中，在37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养2-4h后，去除成纤维细胞，得贴壁的细胞悬液；5)再收集气道上皮细胞；将贴壁的细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；6)获得原代培养的气道上皮细胞(P0)：将再收集的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得原代培养的气道上皮细胞(P0)；7)传代培养气道上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入accutase酶于37℃条件下消化5-10min，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁；当细胞全部悬浮后，加入10％DMEM培养基进行终止消化，收集细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用优化的培养基进行悬浮；8)获得传代培养P20以上的气道上皮细胞：将上述悬浮的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得分离培养的气道上皮细胞(P1)；待P1细胞融合率达到80-90％后，按照步骤7)进行传代培养，连续传代培养80d后，获得传代培养P20以上的气道上皮细胞。步骤6)和步骤8)中所述包被有鼠尾胶原的培养皿是在培养皿中加入适量浓度为50μg/mL的I型鼠尾胶原，室温包被24h后，用PBS缓冲液清洗3次即得。本专利技术培养人气道上皮细胞的优化培养基，包括DMEM培养基、F-12NutirientMix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松(Hydrocrotisone)、胎牛血清(FBS)、25ug/ml的表皮生长因子(hEGF)、5mg/ml的胰岛素(Insulin)、11.7uM的霍乱毒素(Choleratoxin)、10mM的ROCK1抑制剂(Y-27632)、10mM的BMP4拮抗剂(DMH-1)。上述培养人气道上皮细胞的优化培养基，按体积百分比计，由如下成分配制而成：DMEM培养基70～75％F-12NutirientMix培养基15～30％0.5mg/ml的氢化可的松0.001～0.005％胎牛血清5％～8％25ug/ml的表皮生长因子0.001～0.005％5mg/ml的胰岛素0.05～0.2％11.7uM的霍乱毒素0.001～0.00510mM的ROCK1抑制剂0.05～0.2％10mM的BMP4拮抗剂0.005～0.05％。本专利技术的有益效果在于：与现有技术相比，本专利技术利用优化的培养基培养人气道上皮细胞的方法，不仅大大的简化了需要3T3J2细胞为饲养层而培养上皮细胞的步骤，只需要将链霉蛋白酶(pronase)消化的原代人气道上皮细胞培养于本专利技术优化的培养基中，且获得了快速分离且无限传代培养的人气道上皮细胞，将传代培养的人气道上皮细胞进行体外扩增培养，达到20代以上，即可获得足够量的种子细胞用于如体外细胞互作模型研究等诸多后续的体内外研究中。附图说明：图1是本专利技术人气道上皮细胞在优化培养基上的传代培养：P0(I)、P3(II)、P16(III)；图2是三个独立样本的气道上皮细胞倍增时间。具体实施方式：下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不仅限于此，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用技术手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想的前提下，还可以做出其它多种形式的衍化、替换或变更。1.实验材料1.1标本来源：收集在某医科大学总医院普胸外科因肺癌等病因进行手术切除的肺组织。2.主要试剂DMEM高糖培养基(Gibco)、F-12NutrientMix培养基(Gibco)、胎牛血清(BI)、Accutasesolution(细胞消化液)(Millipore)、hEGF(Sigma-Aldrich)、Hydrocrotisone(Sigma-Aldrich)、Y-27632(Sigma-Aldrich)、Choleratoxin(Sigma-Aldrich)、DMH-1(Cot：HY-12273，MedChemExpress)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)清洗人支气管或细支气管：取离体的肺脏组织，去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结蹄组织后，用无菌的剪刀剪成块状于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，备用；2)分离人气道上皮细胞：将清洗好的组织块置于冻存管中，加入预先配置好的消化液，在37℃条件下旋转消化40‑60min后，待气管变软后且有细胞团块或单细胞时，将冻存管中的消化液和组织块一起转移至离心管中，加入胎牛血清至终浓度，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化；3)收集人气道上皮细胞：将消化好的人气道上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行悬浮；4)去除成纤维细胞：将重悬的细胞接种到细胞培养皿中，在37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养2‑4h后，去除成纤维细胞，得贴壁的细胞悬液；5)再收集气道上皮细胞；将贴壁的细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；6)获得原代培养的气道上皮细胞(P0)：将再收集的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2‑3d后，进行换液，即得原代培养的气道上皮细胞(P0)；7)传代培养气道上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80‑90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入accutase酶于37℃条件下消化5‑10min，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁；当细胞全部悬浮后，加入10％DMEM培养基进行终止消化，收集细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用优化的培养基进行悬浮；8)获得传代培养P20以上的气道上皮细胞：将上述悬浮的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2‑3d后，进行换液，即得分离培养的气道上皮细胞(P1)；待P1细胞融合率达到80‑90％后，按照步骤7)进行传代培养，连续传代培养80d后，获得传代培养P20以上的气道上皮细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种快速分离培养人气道上皮细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)清洗人支气管或细支气管：取离体的肺脏组织，去除支气管或细胞支气管周围多余的脂肪和结蹄组织后，用无菌的剪刀剪成块状于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，备用；2)分离人气道上皮细胞：将清洗好的组织块置于冻存管中，加入预先配置好的消化液，在37℃条件下旋转消化40-60min后，待气管变软后且有细胞团块或单细胞时，将冻存管中的消化液和组织块一起转移至离心管中，加入胎牛血清至终浓度，盖上盖子，轻轻上下颠倒20次达到终止消化；3)收集人气道上皮细胞：将消化好的人气道上皮细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行悬浮；4)去除成纤维细胞：将重悬的细胞接种到细胞培养皿中，在37℃，5％CO2条件下的培养箱中培养2-4h后，去除成纤维细胞，得贴壁的细胞悬液；5)再收集气道上皮细胞；将贴壁的细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；6)获得原代培养的气道上皮细胞(P0)：将再收集的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养2-3d后，进行换液，即得原代培养的气道上皮细胞(P0)；7)传代培养气道上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80-90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入accutase酶于37℃条件下消化5-10min，待细胞变圆后，轻轻拍打培养皿的侧壁；当细胞全部悬浮后，加入10％DMEM培养基进行终止消化，收集细胞悬液于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，细胞沉淀用优化的培养基进行悬浮；8)获得传代培养P20以上的气道上皮细胞：将上述悬浮的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％C...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓明，杨佳丽，石娟，何进喜，贾圆圆，薛菁，夏鹤春，
申请(专利权)人：宁夏医科大学总医院，
类型：发明
国别省市：宁夏,64