双特异性T细胞活化性抗原结合分子制造技术

本发明专利技术一般涉及用于T细胞活化和对特定靶细胞重定向的新颖双特异性抗原结合分子。另外，本发明专利技术涉及编码此类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，和包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明专利技术进一步涉及用于生成本发明专利技术的双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】双特异性T细胞活化性抗原结合分子专利
本专利技术一般涉及用于活化T细胞的双特异性抗原结合分子。另外，本专利技术涉及编码此类双特异性抗原结合分子的多核苷酸，以及包含此类多核苷酸的载体和宿主细胞。本专利技术进一步涉及用于生成本专利技术的双特异性抗原结合分子的方法，以及在疾病的治疗中使用这些双特异性抗原结合分子的方法。专利技术背景在多种临床背景中常常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，特异性破坏肿瘤细胞而使健康细胞和组织保持完整且不受损是癌症疗法的首要目的。实现这点的一种有吸引力的方式是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，使得免疫效应细胞诸如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。CTL构成免疫系统最有力的效应细胞，然而它们不能通过由常规治疗性抗体的Fc域介导的效应器机制来激活。在此点上，最近数年对双特异性抗体变得感兴趣，其设计为用一个“臂”结合靶细胞上的表面抗原，而用第二个“臂”结合T细胞受体(TCR)复合物的活化性的，不变的组分。此类抗体对其两种靶物的同时结合会迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用，引起任何细胞毒性T细胞活化和随后的靶细胞裂解。因此，免疫应答重定向于靶细胞，而且不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性，其对于CTL的正常MHC限制性活化会是相关的。在此背景中，至关重要的是CTL仅在靶细胞向其呈递双特异性抗体时活化，即模拟免疫突触。特别期望的是不需要淋巴细胞预条件化或共刺激来引发靶细胞有效裂解的双特异性抗体。已开发出数种双特异性抗体型式并研究了它们对调查中的T细胞介导的免疫疗法的适宜性。其中，所谓的BiTE(双特异性T细胞衔接物(engager))分子已得到非常好的表征，而且在临床中已显示出一些前景(综述见Nagorsen和ExpCellRes317,1255-1260(2011))。BiTE是串联scFv分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合。针对T细胞衔接评估的其它双特异性型式包括双抗体(Holliger等,ProtEng9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双抗体(Kipriyanov等,JMolBiol293,41-66(1999))。一项最近的进展是所谓的DART(双重亲和力重靶向)分子，它们基于双抗体型式但特征在于实现额外稳定化的C端二硫桥(Moore等,Blood117,4542-51(2011))。所谓的triomab(它们是完整杂合小鼠/大鼠IgG分子，而且目前亦在临床试验中进行评估)代表了尺寸更大的型式(综述见Seimetz等,CancerTreatRev36,458-467(2010))。正在开发的多种型式显示免疫疗法中归因于T细胞重定向和活化的极大潜力。然而，生成对此合适的双特异性抗体的任务绝不是微不足道的，而是牵涉到许多必须满足的与抗体功效，毒性，适用性和生产能力有关的挑战。小构建体诸如例如BiTE分子(尽管能够有效交联效应器和靶细胞)具有非常短的血清半衰期，从而需要通过连续输注对患者施用它们。另一方面，IgG样型式(尽管具有长半衰期的极大益处)受制于与IgG分子固有的天然效应器功能有关的毒性。它们的免疫原性潜力构成了成功治疗性开发的IgG样双特异性抗体(尤其是非人型式)的另一个不利特征。最后，双特异性抗体的一般开发中的一项主要挑战是以临床充足的数量和纯度生产双特异性抗体构建体，原因在于具有不同特异性的抗体重和轻链在共表达后的错配，这降低了正确装配的构建体的产量且导致许多无功能的副产物，而期望的双特异性抗体可能难以与之分开。已经采取了不同的办法来克服双特异性抗体中的链联合问题(参见例如Klein等,mAbs6,653-663(2012))。例如，‘节-入-穴’策略的目标在于通过在CH3域中引入突变以修饰接触界面来推动两条不同抗体重链的配对。在一条链上将大氨基酸用具有短侧链的氨基酸替换以创建‘穴’。相反，在另一个CH3域中引入具有大侧链的氨基酸以创建‘节’。通过共表达这两种重链(和两条相同轻链，它们必须是对于两种重链都是适宜的)，观察到异二聚体(‘节-穴’)对同二聚体(‘穴-穴’或‘节-节’)的高产量(Ridgway,J.B.等,ProteinEng.9(1996)617-621；及WO96/027011)。通过使用噬菌体展示办法重新塑造两个CH3域的相互作用表面及引入二硫桥以稳定化异二聚体能进一步提高异二聚体的百分比(Merchant,A.M.等,NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。节-入-穴技术的新办法记载于例如EP1870459A1。然而，‘节-入-穴’策略没有解决包含不同轻链来结合不同靶抗原的双特异性抗体中发生的重链-轻链错配的问题。防止重链-轻链错配的一种策略是在双特异性抗体的结合臂之一的重和轻链之间交换域(参见WO2009/080251,WO2009/080252,WO2009/080253,WO2009/080254及Schaefer,W.等,PNAS,108(2011)11187-11191，其涉及具有域交换的双特异性IgG抗体)。交换双特异性抗体的结合臂之一中的重和轻链可变域VH和VL(WO2009/080252，还可参见Schaefer,W.等,PNAS,108(2011)11187-11191)明显减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链的错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。不过，这些抗体制备物并非完全不含副产物。主要的副产物基于BenceJones型相互作用(Schaefer,W.etal,PNAS,108(2011)11187-11191；附录中的图S1I)。因而想要进一步减少此类副产物以提高例如此类双特异性抗体的产量。T细胞抗原和靶细胞抗原二者的靶抗原和适宜结合物的选项是用于治疗性应用的T细胞双特异性(TCB)抗体的生成中的又一个至关紧要方面。STEAP-1(前列腺六次跨膜上皮抗原-1)是一种339个氨基酸的细胞表面蛋白，其在正常组织中主要在前列腺细胞中表达。STEAP-1蛋白质表达在前列腺癌的各个阶段间以高水平维持，而且STEAP-1还在其它人癌症诸如肺和结肠中高度过表达。STEAP-1在正常和癌组织中的表达概况提示它作为免疫疗法的靶物的潜在用途。WO2008/052187报告了抗STEAP-1抗体及其免疫缀合物。STEAP-1/CD3(scFv)2双特异性抗体在WO2014/165818中有描述。本专利技术提供设计用于T细胞活化和重定向的，靶向STEAP-1和活化性T细胞抗原诸如CD3的，新颖的，改良的双特异性抗原结合分子，其组合了优良的功效和生产能力与较低的毒性和有利的药动学特性。专利技术概述专利技术人开发了新颖的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其具有出乎意料的，改善的靶向STEAP-1的特性。如此，在第一个方面，本专利技术提供一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(a)特异性结合第一抗原的第一抗原结合模块；(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中所述第一抗原是活化性T细胞抗原且所述第二抗原是STEAP-1，或所述第一抗原是STEAP-1且所述第二抗原是活化性T细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(a)特异性结合第一抗原的第一抗原结合模块；(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中所述第一抗原是活化性T细胞抗原且所述第二抗原是STEAP‑1，或所述第一抗原是STEAP‑1且所述第二抗原是活化性T细胞抗原；且其中特异性结合STEAP‑1的所述抗原结合模块包含重链可变区，特别是人源化重链可变区，其包含SEQ ID NO：14的重链互补决定区(HCDR)1，SEQ ID NO：15的HCDR 2和SEQ ID NO：16的HCDR 3，和轻链可变区，特别是人源化轻链可变区，其包含SEQ ID NO：17的轻链互补决定区(LCDR)1，SEQ ID NO：18的LCDR 2和SEQ ID NO：19的LCDR 3。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 EP 15188037.41.一种T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其包含(a)特异性结合第一抗原的第一抗原结合模块；(b)特异性结合第二抗原的第二抗原结合模块；其中所述第一抗原是活化性T细胞抗原且所述第二抗原是STEAP-1，或所述第一抗原是STEAP-1且所述第二抗原是活化性T细胞抗原；且其中特异性结合STEAP-1的所述抗原结合模块包含重链可变区，特别是人源化重链可变区，其包含SEQIDNO：14的重链互补决定区(HCDR)1，SEQIDNO：15的HCDR2和SEQIDNO：16的HCDR3，和轻链可变区，特别是人源化轻链可变区，其包含SEQIDNO：17的轻链互补决定区(LCDR)1，SEQIDNO：18的LCDR2和SEQIDNO：19的LCDR3。2.依照权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中特异性结合STEAP-1的所述抗原结合模块包含包含与SEQIDNO：20的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQIDNO：21的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。3.依照权利要求1的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中特异性结合STEAP-1的所述抗原结合模块包含包含SEQIDNO：32的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO：21的氨基酸序列的轻链可变区。4.依照权利要求1-3任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合模块和/或所述第二抗原结合模块是Fab分子。5.依照权利要求1-4任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第二抗原结合模块是特异性结合第二抗原的Fab分子，且其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH或恒定域CL和CH1是彼此替换的。6.依照权利要求1-5任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原是STEAP-1且所述第二抗原是活化性T细胞抗原。7.依照权利要求1-6任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中所述活化性T细胞抗原是CD3，特别是CD3ε。8.依照权利要求1-7任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中特异性结合所述活化性T细胞抗原的所述抗原结合模块包含SEQIDNO：4的重链互补决定区(CDR)1，SEQIDNO：5的重链CDR2，SEQIDNO：6的重链CDR3，SEQIDNO：8的轻链CDR1，SEQIDNO：9的轻链CDR2和SEQIDNO：10的轻链CDR3。9.依照权利要求1-8任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中特异性结合所述活化性T细胞抗原的所述抗原结合模块包含包含与SEQIDNO：3的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQIDNO：7的氨基酸序列至少约95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列的轻链可变区。10.依照权利要求1-9任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中(a)下的第一抗原结合模块是特异性结合第一抗原的第一Fab分子，(b)下的第二抗原结合模块是特异性结合第二抗原的第二Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变域VL和VH是彼此替换的；且i)在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)；或ii)在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。11.依照权利要求10的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。12.依照权利要求10或11的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。13.依照权利要求10-12任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。14.依照权利要求10-13任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。15.依照权利要求10-13任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在a)下的第一Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。16.依照权利要求10的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸或位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。17.依照权利要求10或16的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。18.依照权利要求10，16和17任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)，精氨酸(R)或组氨酸(H)独立替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)，或天冬氨酸(D)独立替代(编号方式依照KabatEU索引)。19.依照权利要求10和16-18任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用精氨酸(R)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)。20.依照权利要求10和16-18任一项的T细胞活化性双特异性抗原结合分子，其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CL中位置124处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)且位置123处的氨基酸用赖氨酸(K)替代(编号方式依照Kabat)，且其中在b)下的第二Fab分子的恒定域CH1中位置147处的氨基酸用谷氨酸(E)替代(编号方式依照KabatEU索引)且位置213处的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·巴卡克，T·霍弗，S·伊姆霍夫荣格，C·克莱因，S·克洛斯特曼，M·莫尔霍，T·纳亚克，J·T·莱古拉，W·谢弗，P·尤马纳，T·魏因齐尔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH