本发明专利技术公开了一种Ｔ载体及其制备方法，其目的是提供一种具有较高ＴＡ克隆效率的Ｔ载体及其制备方法，包括ｐＢｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＳＫ（－）的Ａｍｐ↑［ｒ］基因序列，ｐＢｌｕｅ ＳｃｒｉｐｔⅡ ＳＫ（－）的ＣｏｌＥＩ ｏｒｉ序列，ｐＢｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＳＫ（－）的ｆｌｏｒｉ序列，ｐＢｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ ⅡＳＫ（－）的ｌａｃＺ基因序列，ｐＢｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＳＫ（－）的Ｔ３噬菌体启动子序列，ｐＢｌｕｅ ＳｃｒｉｐｔⅡ ＳＫ（－）的Ｔ７噬菌体启动子序列以及分别位于两个末端的各一个多克隆位点序列，其中，所述Ａｍｐ↑［ｒ］基因序列中的ＡｈｄＩ酶切位点被沉默，所述两个多克隆位点均具有３′突出Ｔ末端。本发明专利技术的Ｔ载体及其制备方法将在基因工程领域中发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域中一种载体及其构建方法，特别涉及一种。
技术介绍
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规实验技术。绝大多数情况下需要将PCR扩增产物克隆到质粒载体上，以便对PCR产物进行测序、体外转录、体外翻译等操作。克隆PCR产物的方法有很多种，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所谓TA克隆就是将3’端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3’端具有单个T尾巴的T载体上。TA克隆的理论依据是在PCR扩增过程中，由于Taq聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3’末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的脱氧腺苷酸(A)(Clark，J.M.，1988.Novelnon-templated nucleotide addition reactions catalyzed prokaryotic andeucaryotic DNA polymerase.Nucleic Acids Res.16，9677-9686；Cha，J.，Bishai，W.，Chandrasegaran，S.，1993.New vectors for direct cloning of PCR products.Gene 136，369-370；Schutte，B.C.，Ranade，K.，Pruessner，J.，Dracopoli，N.，1997.Optimized conditions for cloning PCR products into an XcmI T-vector.BioTechniques 22，40-42)，使得50％以上的PCR产物的3’末端具有单个脱氧腺苷酸，即3’端A尾巴(Ichihara，Y.，Kurosawa，Y.，1993.Construction of new Tvectors for direct cloning of PCR products.Gene 130，153-154)。目前，T载体的制备方法有3种。第一种方法是利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3’端(Holton，T.A.，Graham，M.W.，1991.A simple and efficientmethod for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.NucleicAcids Res.19，1156)。第二种方法是利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到线状载体的3’端(Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.，Collins，F.S.，1991.Construction of T-vectors，a rapid andgeneral system for direct cloning of unmodified PCR products.Nucleic AcidsRes.19，1154)。第三种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3’端具有单个T突出的线性T载体。前两种方法在制备T载体过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题(Shuman，S.，1994.Novel approach to molecular cloning andpolynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase.J.Biol.Chem.265，32678-32684)。与前两种方法相比，第三种方法更快捷、更高效以及更稳定。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括XcmI(Jo，C.，Jo，S.A.，2001.A simple methodto construct T vectors using Xcm I cassettes amplified by nonspecific PCR.Plasmid 45，37-40；Arashi，N.，Miwa，M.，Shibata，H.，1999.XcmIsite-containing vector for direct cloning and in vitro transcription for PCRproduct.Mol.Biotechnol.12，281-283)、AhdI/Eam1105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI(Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products.Plasmid48，160-163；Ichihara，Y.，Kurosawa，Y.，1993.Construction of new T vectorsfor direct cloning of PCR products.Gene 130，153-154)、BfiI/BmrI、HphI/AsuHPI(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，Smith，L.M.，1991.A universal method for the direct cloning of PCR amplified nucleic acid.Bio/Technology 9，657-663)、MboII/NcuI，BfuI/BciVI，HpyAV/Hin4II。其中XcmI和AhdI及其同裂酶在制备T载体中得到广泛应用。其它内切酶要么因为太昂贵，要么因为在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体中的应用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆载体中，例如pUC18、pBlueScript SK载体等，都不具有XcmI酶切位点，但在Amp抗性基因中含有一个AhdI及其同裂酶的酶切位点，因而在这些载体的多克隆位点引入XcmI位点更方便一些，这就是为什么更多人采用XcmI制备T载体(美国专利文献US005487993A；中国专利文献CN1142279C，CN1344795A以及CN1362521A)。如果要引入AhdI及其同裂酶的酶切位点，则必须通过定点突变的方法沉默Amp抗性基因中相应的酶切位点。尽管如此，利用AhdI及其同裂酶制备T载体比起XcmI更有优势，表现在如下几个方面。第一，AhdI有5种同裂酶，其中的4种同裂酶已经商品化，因而加上AhdI有5种内切酶可供选用，而XcmI没有同裂酶(Roberts R.J.，T.Vincze，J.Posfai，and D.Macelis.2003.REBASErestriction enzymes andmethyltransferases.Nucleic Acids Res.314本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｔ载体，包括ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔⅡＳＫ（－）的Ａｍｐ↑［ｒ］基因序列，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔⅡＳＫ（－）的ＣｏｌＥＩｏｒｉ序列，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔⅡＳＫ（－）的ｆｌｏｒｉ序列，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ⅡＳＫ（－）的ｌａｃＺ基因序列，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔⅡＳＫ（－）的Ｔ３噬菌体启动子序列，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔⅡＳＫ（－）的Ｔ７噬菌体启动子序列以及分别位于两个末端的各一个多克隆位点序列，其特征在于：所述Ａｍｐ↑［ ｒ］基因序列中的ＡｈｄＩ酶切位点被沉默，所述两个多克隆位点均具有３′突出Ｔ末端。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈其军，王学臣，周海梦，
申请(专利权)人：清华大学，中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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