一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体技术

本发明专利技术一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品。将鸡α干扰素的基因序列通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，表达外源蛋白的纯度高于７０％，经过６５６３６倍稀释发现能完全抑制１００－１０００ＴＣＩＤ↓［５０］的水疱性口炎病毒的攻击。鸡α干扰素对ＶＳＶ和禽流感病毒的转录、翻译阶段抑制能力尤其明显，对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒等也都有较强的抑制作用，而且还有强大抗肿瘤、抗增殖作用，对鸡的马立克氏病毒也具有较强的抑制作用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种重组鸡α干扰素的生产方法，包括：（一）重组到毕赤酵母上的鸡α干扰素的基因序列的扩增Ａ）引物的设计：引物１：５‘ＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＣＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣ’３引物２：５‘ＣＣＧＡＴＣＴＡＧＡＧ ＴＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡ’３Ｂ）鸡全血淋巴细胞总ＲＮＡ的提取取５００μＬ培养以ＣｏｎＡ刺激４～１０ｈ的鸡全血分离的淋巴细胞的悬液，向其中加入８００μＬＴｒｉｐｕｒｅ细胞裂解液，振荡混匀后，置于室温下１０ｍｉｎ，然后向其中加 入２００μＬ氯仿，混匀后于室温下静置５ｍｉｎ分钟，再于１２０００ｇ４℃下离心１５ｍｉｎ；吸取上清，向其中加入０．５倍体积的异丙醇，充分混匀后于室温下静置１５ｍｉｎ，随后在１２０００ｇ４℃下离心１０ｍｉｎ；排尽管内液体，向管内加入１ｍＬ７０％乙醇进行洗涤，混匀后，７５００ｇ４℃离心５ｍｉｎ；弃去液体，待管壁稍干燥后加入２０μＬＤＥＰＣ处理的超纯水溶解，即得到鸡淋巴细胞总ＲＮＡ；Ｃ）含有鸡α干扰素基因序列ｃＤＮＡ第一条链的合成用新鲜提取的淋巴细胞的总ＲＮＡ进行ＲＴ －ＰＣＲ，具体加样如下：细胞总ＲＮＡ９．２μＬ５×反转录Ｂｕｆｆｅｒ４．０μＬ１０ｍＭｄＮＴＰ２．０μＬ２５ｍＭＭｇＣＩ↓［２］０．８μＬ　Ｒｎａｓｉｎ１．０μＬ引 物１１．０μＬ引物２１．０μＬ将上述反应混合物于掌式离心机上稍作离心，然后于在ＰＣＲ仪；上６５℃１５ｍｉｎ后加入反转录酶Ｍ－ＭＬＶ１．０μＬ，后４２℃１ｈ，９４℃５ｍｉｎ后结束反应；Ｄ）ＰＣＲ反应体系如下：　 　ｄｄＨ↓［２］Ｏ３４μＬ１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ４．０μＬ２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ↑［２＋］１．４μＬＲＴ产物１０μＬｒＴａｑ０．６μＬ总体积５０μＬ在ＰＣＲ 仪上设置９４℃５ｍｉｎ，随后９４℃１ｍｉｎ，５６℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，共３０个循环，结束循环后７２℃１０ｍｉｎ；对ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡α干扰素基因大小为４８８ｂｐ；（二）含有鸡α干扰素成熟蛋白基因酵母表达载 体的构建与鉴定利用通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增的鸡α干扰素成熟蛋白基因有ＥＣＯＲⅠ和ＸｂａⅠ两个酶切位点，把鸡α干扰素成熟蛋白基因切下...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈溥言，蔡梅红，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]