系列通用型腺病毒伴随病毒载体的构建及用途制造技术

本发明专利技术涉及一系列通用型腺病毒伴随病毒（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）载体的构建，这些载体包括ｐＷＡＶ－１、ｐＷＡＶ－２、ｐＳＮＡＶ－１和ｐＳＮＡＶ－２。其共同特征是每种载体均提供２型ＡＡＶ两端的ＩＴＲ、巨细胞病毒（ＣＭＶ）立早增强子和启动子、多克隆位点和ｐｏｌｙ　Ａ信号。本发明专利技术提供了用上述通用型ＡＡＶ载体构建携带外源基因的ＡＡＶ载体质粒的方法。含有外源基因的ＡＡＶ载体质粒既可用于产生重组ＡＡＶ，又可直接作为真核表达质粒使用。ｐＳＮＡＶ－１和ｐＳＮＡＶ－２除具有上述共同特征外，还含有新霉素抗性基因表达盒。本发明专利技术利用这一特征，提供了用含有外源基因的ｐＳＮＡＶ－１或ｐＳＮＡＶ－２质粒建立稳定携带ＡＡＶ载体的细胞株的方法。本发明专利技术进一步提供了“一株载体细胞／一株辅助病毒”的重组ＡＡＶ生产方法，即用我们先前发明专利技术的一种用于重组ＡＡＶ大规模生产的全功能辅助病毒（已申报专利，申请号９８１２００３３．８）感染ＡＡＶ载体细胞株，实现重组ＡＡＶ的大规模生产。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物技术专利
基因治疗是20世纪90年代发展起来的一种全新的疾病治疗模式，它通过向人的体细胞导入治疗基因发挥对疾病的治疗作用。目前，全世界已有三百多个基因治疗的临床方案获得批准，数以千计的患者接收了临床试验。基因治疗的对象也从最初的遗传病、肿瘤逐步扩大到心血管病、感染性疾病等。随着研究的不断深入与完善，基因治疗必将在21世纪对临床医学产生巨大的推动作用。将治疗基因导入人体细胞是基因治疗的必经步骤，而治疗基因需要合适的载体来运载。用于基因治疗的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type2，AAV-2)是一种复制缺陷性的微小病毒，由于具有对人类不致病、可感染有丝分裂后细胞、其基因组可定点整合至人19号染色体等特点，有望发展成为理想的基因治疗载体，因而在近年来的基因治疗研究中很受重视。制备携带外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)的常规方法涉及两个质粒，一个是携带外源基因(即治疗基因)表达盒及AAV-2倒转末端重复序列(inverted terminal repeats，ITR)的载体质粒，其中的ITR是rAAV复制和包装所需的最短的顺式序列；另一个是含有AAV-2 rep和cap基因的助手质粒，可反式提供rAAV复制和包装所需的蛋白。将两个质粒一起转染细胞，再用辅助病毒(腺病毒或单纯疱疹病毒)感染，才能包装出含外源基因的rAAV假病毒颗粒。我们曾专利技术了一种用于rAAV大规模生产的全功能辅助病毒(已申报专利，申请号98120033.8)，简化了生产步骤并提高了产量。制备rAAV的第一步需构建携带治疗基因的AAV载体质粒。目前，构建AAV载体质粒的常规方法需从含有AAV-2全基因组的质粒(如Sub201)入手，卸下其中的rep和cap基因，只保留两端ITR，再依次装入启动子、治疗基因和poly A信号，步骤繁琐，费时费力，亟待改进。通过提供一系列通用型的AAV载体质粒及其构建方法、提供用这些通用型载体质粒构建携带治疗基因的AAV载体质粒方法，简化构建携带治疗基因的AAV载体质粒的步骤。本专利技术涉及一系列通用型AAV载体的构建，这些载体包括pWAV-1、pWAV-2、pSNAV-1、pSNAV-2。其共同特征是每种载体均提供AAV-2两端的ITR、巨细胞病毒(CMV)立早增强子和启动子、多克隆位点和poly A信号。本专利技术提供了用上述通用型AAV载体构建携带外源基因的AAV载体质粒的方法。含有外源基因的AAV载体质粒既可用于产生重组AAV，又可直接作为真核表达质粒使用。pSNAV-1和pSNAV-2除具有上述共同特征外，还含有新霉素抗性基因表达盒。本专利技术利用这一特征，提供了用含有外源基因的pSNAV-1和pSNAV-2质粒建立稳定携带AAV载体的细胞株的方法。本专利技术进一步提供了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的rAAV生产方法，即用我们先前专利技术的一种用于rAAV大规模生产的全功能辅助病毒(已申报专利，申请号98120033.8)感染AAV载体细胞株，实现重组AAV的大规模生产。用于本专利技术的原始生物材料pSub 201，为Samulski实验室赠送的含有AAV-2全基因组的质粒；pUCMA，为本室先前构建的含有CMV立早增强子和启动子、多克隆位点及polyA的质粒；tgCMV/HyTK，含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的HyTK基因的真核表达质粒；pAV53，为携带氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点的AAV载体质粒；pSV2neo，为Promega公司生产的表达新霉素抗性基因的真核表达质粒；pCMV-lacZ，为本室先前构建的含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的β-半乳糖苷酶基因的真核表达质粒；pCD2，含有CMV立早增强子和启动子及其控制下的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因及SV40早期启动子控制下的新霉素抗性基因的逆转录病毒载体质粒；以上质粒的宿主菌为Escherichia coli大肠杆菌MAX EFFICIENCY DH5α(GIBCO#18528-012)。系列通用型AAV载体质粒的构建过程及特征pWAV-1的构建过程及特征见附附图说明图1。将pSub201中AAV-2的rep和cap基因用Xba I切除，只保留质粒骨架及AAV-2基因组两端的ITR；将pUCMA中CMV立早启动子、多克隆位点及polyA序列用XbaI卸下，装入上述两个ITR中间，构建成重组AAV载体质粒pWAV-1。该载体含有AAV-2基因组两端的ITR，在两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、嵌合内含子、多克隆位点和polyA信号。CMV立早增强子和启动子、嵌合内含子部分共约1.1kb。嵌合内含子由人β珠蛋白基因第一个内含子的5’剪切供者位点和免疫球蛋白基因重链可变区的3’剪切受者位点构成，将其放置于待插入基因的上游，作用是使mRNA前体在此处剪切成为成熟mRNA，并防止利用插入基因内部可能的5’剪切供者位点进行剪切。该载体的多克隆位点包括Nhe I、XhoI、Pst I和BamH I，便于外源基因插入。质粒的骨架为pEMBL，含有在大肠杆菌中进行复制所需的复制起点序列和氨苄青霉素抗性基因。由于rAAV的最大包装限度为约5kb，而两个ITR、CMV立早增强子和启动子、嵌合内含子、多克隆位点和polyA信号共约1.7kb，因此，所能容纳的外源基因长度小于3.3kb。pWAV-2的构建过程及特征见附图2。将pCMVHyTK质粒用Nhe I和Hind III双切卸下HyTK基因，回收余下的2.9kb的片段，用Klenow大片段DNA聚合酶和dNTP将粘端补平后自连，构成重组质粒pCMVPA。用XhoI和BamH I双切pCMVPA，回收950bp的CMV和polyA片段；将pAV53质粒用Xho I和BamH I双切，卸下氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌复制起点，只保留质粒骨架及AAV-2基因组两端的ITR，与上述CMV和polyA片段相连接，成为pWAV-2。pWAV-2也含有AAV-2基因组两端的ITR，在两个ITR之间依次为CMV立早增强子和启动子、多克隆位点和payA信号。质粒的骨架上含有在大肠杆菌中进行复制所需的复制起点序列和氨苄青霉素抗性基因。多克隆位点包括Kpn I、EcoR I、Sal I。所能容纳的外源基因长度小于3.6kb。pSNAV-I的构建过程及特征见附图3。首先采用酶切、补平、再连接的方式，经两步克隆去除pSV2neo上的EcoR I和Bgl II位点，成为pSV2neoΔEΔB；将pCMV-lacZ中CMV启动子控制下的LacZ表达盒用Xho I和BamH I切出并回收，连接入pAV53质粒用Xho I和BamH I双切后的ITR中间，构成携带LacZ表达盒的AAV载体质粒pAV-LacZ，pAV-LacZ用Bgl II酶切，回收ITR-CMV-LacZ-ITR片段，连接入pSV2neoΔEΔB的BamH I位点，构成携带LacZ表达盒的又-AAV载体质粒pSNAV-lacZ；用Xho I和BamH I双切pSNAV-lacZ，去除其中的La本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术属于生物技术专利技术领域，具体涉及用于基因转移、基因治疗和真核基因表达的一系列通用型腺病毒伴随病毒（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）载体质粒。 本专利技术构建的通用型ＡＡＶ载体质粒ｐＷＡＶ－１、ｐＷＡＶ－２，其特征是含有２型ＡＡＶ（ＡＡＶ－２）基因组两端的ＩＴＲ，在两个ＩＴＲ之间依次为巨细胞病毒立早增强子和启动子、多克隆位点和ｐｏｌｙＡ信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小兵，侯云德，伍志坚，曹晖，
申请(专利权)人：本元正阳基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]