超螺旋质粒的分离纯化的方法与应用技术

一种用疏水层析介质分离ＲＮＡ的方法，其特征是，该方法包括：在细胞破碎含核酸的提取液中加入盐调节电导；再上样到预先用缓冲液平衡好的疏水层析介质柱子；然后分别以缓冲液和水洗脱柱子，洗脱下来ＲＮＡ，从而分离ＲＮＡ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
具体涉及大规模、高纯度提取和纯化质粒尤其是超螺旋质粒的工艺及其应用。
技术介绍
高纯度质粒的提取和纯化一直是个很难解决的问题，而且成本很高，特别是作为治疗用的DNA疫苗的质粒，它对质粒的纯度要求是超螺旋质粒＞90％以上，这用一般的方法是很难达到的。而目前基因治疗是一个日渐看好的方法，那么如何得到高纯度质粒是最关键的问题，同时在很多的上游研究中，获得高纯度的质粒都是必须的前提的，所以它同样需要一种很好的得到高纯度质粒的方法。因为只有超螺旋的质粒有最好的转染能力，但是要把非超螺旋质粒和超螺旋质粒分离一直是个难题。由于非超螺旋质粒和超螺旋质粒的性质极为相似，所以用离子交换，凝胶过滤等普通的分离手段很难把它们分开，而且这些方法大多烦琐，时间长。疏水相互作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography HIC，或称疏水层析)原理是在高的盐浓度时，蛋白质通过疏水作用会吸附在疏水层析介质的疏水基团上，当逐渐降低洗脱液的盐浓度时，它们会按疏水性的强弱先后被洗脱，这样达到对蛋白质大分子进行分离的目的。因疏水层析介质价格廉价以及纯化后的蛋白质大分子仍然保持原有的生物活性，而且有很高的分辨率，疏水层析已成为较新的发展前途广阔的用于蛋白质大分子分离纯化的最有效的手段之一，疏水层析常应用在蛋白质的分离和纯化中。
技术实现思路
本专利技术提供了一种全新的纯化高纯度超螺旋质粒的方法。我们研究发现非超螺旋质粒和超螺旋质粒在立体结构中有一定的差别，这种差别使得超螺旋质粒比非超螺旋质粒疏水性强，因此我们根据超螺旋质粒与非超螺旋质粒疏水性的差异开创性地用疏水层析来分离非超螺旋质粒和超螺旋质粒，这样分离得到很好的收率，纯度也很高，时间短，成本低，这为得到高纯度超螺旋质粒提供了一种最快最有效的分离纯化的手段。本专利技术用一步疏水层析纯化法就可以得到纯度＞90％的超螺旋质粒，而收率也＞80％，是很好的分离纯化超螺旋质粒的方法。同时也提供了一种利用疏水层析分离RNA的简便易行的方法。在质粒提取过程中，含有很多的RNA，一般去除的方法都是用凝胶过滤和离子交换等方法，这些方法大多烦琐，时间长，而用本专利技术的疏水层析介质一步就可以把RNA分离，首先用本专利技术的疏水层析介质分离RNA或者用凝胶过滤和离子交换等方法分离RNA，然后再用疏水层析就可以得到纯度＞90％的超螺旋质粒，本专利技术操作步骤简化且大大降低了成本，而且有利于放大。根据本专利技术用疏水层析介质分离RNA、超螺旋质粒的方法，该方法包括将含有质粒的细胞破碎，再提取核酸获得含有核酸的提取液，然后对将细胞破碎含核酸的提取液进行分离，分离时首先要分离RNA，再分离超螺旋质粒。1.RNA的分离在细胞破碎含核酸的提取液加入盐调节电导，再上样到预先用缓冲液平衡好的疏水层析介质柱子，收集穿透峰，然后分别以缓冲液和水洗脱柱子，洗脱下来RNA，从而分离RNA；在RNA的分离中，在细胞破碎含核酸的提取液加入盐，用盐调电导较好为100-270ms/cm，更好为120-250ms/cm，适用的盐包括(NH4)2SO4、NaCl等；平衡疏水层析介质柱子的缓冲夜和洗脱疏水层析介质柱子的缓冲液可选用(NH4)2SO4，EDTA和Tris，其中平衡用缓冲夜(NH4)2SO4的浓度较好为1-4.5摩尔/升，更好为1.5-4摩尔/升；EDTA浓度较好为10-100毫摩尔/升，更好为20-80摩尔/升；Tris的浓度为10-100毫摩尔/升，更好为20-80摩尔/升；PH值为6.0-7.4。洗脱用缓冲夜(NH4)2SO4的浓度较好为0.5-2摩尔/升，更好为1-2摩尔/升；EDTA浓度较好为10-100毫摩尔/升，更好为1-2摩尔/升；Tris的浓度为10-100毫摩尔/升，更好为20-80摩尔/升；PH值为6.0-7.4。2.超螺旋质粒的纯化将上述RNA的分离操作中所收集的穿透峰或用凝胶过滤和离子交换等其他方法去除了RNA的样品，用盐调节电导，然后上样到用缓冲液平衡好的疏水层析柱子，上样完后再用缓冲液洗脱，收集洗脱峰得到纯度大于90％的超螺旋质粒。超螺旋质粒的纯化中，用盐调电导较好为100-270ms/cm，更好为120-250ms/cm，适用的盐包括(NH4)2SO4、NaCl等；平衡疏水层析介质柱子的缓冲夜和洗脱疏水层析介质柱子的缓冲液可选用(NH4)2SO4，EDTA和Tris，其中平衡用缓冲夜(NH4)2SO4的浓度较好为1-4.5摩尔/升，更好为1.5-4摩尔/升；EDTA浓度较好为10-100毫摩尔/升，更好为20-80摩尔/升；Tris的浓度为10-100毫摩尔/升，更好为20-80摩尔/升；PH值为7.6-9.0。洗脱用缓冲夜(NH4)2SO4的浓度较好为0.5-2摩尔/升，更好为1-2摩尔/升；EDTA浓度较好为10-100毫摩尔/升，更好为1-2摩尔/升；Tris的浓度为10-100毫摩尔/升，更好为20-80摩尔/升；PH值为7.6-9.0。附图说明图1是用疏水层析去除RNA。图2是疏水层析去除RNA的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1上样； 泳道2穿透； 泳道3盐洗脱；3水洗脱。图3是疏水层析分离超螺旋质粒的层析图。图4是疏水层析分离超螺旋质粒的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1上样； 泳道2穿透； 泳道3洗脱。图5是疏水层析分离超螺旋质粒的层析图；其中泳道1上样； 泳道2穿透； 泳道3洗脱。图6是疏水层析分离超螺旋质粒的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1上样； 泳道2穿透； 泳道3洗脱。图7是疏水层析分离超螺旋质粒的层析图。图8是疏水层析分离超螺旋质粒的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1上样； 泳道2穿透； 泳道3洗脱。具体实施例方式以下通过实施例结合附图对本专利技术作进一步详细说明，这并不限制本专利技术的范围。实施例1 疏水层析去除RNA。将细菌破碎含核酸的提取液50ml加入硫酸铵调电导为200ms/cm，然后把它上样到预先用2M(NH4)2SO4，20mM EDTA，80mM Tris，pH6.8缓冲液平衡好的1.6×20cm的疏水层析柱子，流速保持为10-300cm/小时，收集穿透峰就是去除了RNA的质粒，再分别以1M(NH4)SO4，20mMEDTA，80mM Tris，pH6.8缓冲液和水洗脱柱子，洗脱都是RNA，层析图和电泳结果分别见图1和图2。实施例2 疏水层析纯化超螺旋质粒将由实施例1得到穿透的样品，用硫酸铵调电导为200ms/cm，然后上样到2M(NH4)2SO4，20mM EDTA，80mM Tris，pH8.0平衡好的1.6×20cm疏水层析柱子，流速保持为10-300cm/小时，上样完后再用1M(NH4)2SO4，20mM EDTA，80mM Tris，pH8.0缓冲液洗脱，收集洗脱峰得到纯度大于90％的超螺旋质粒。层析图和电泳分别见图3和图4。实施例3 疏水层析纯化超螺旋质粒将用凝胶过滤层析去除RNA的样品，用硫酸铵调电导为200ms/cm，然后上样到用2M(NH4)2SO4，20mM EDTA，80mM Tris，pH8.0平衡好的1.6×20cm疏水层析柱子，流速保持为10-300cm/小时，上样完后再用1M(NH4)2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韦新桂，
申请(专利权)人：本元正阳基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：