人源化的胶原抗体及相关方法技术

本发明专利技术提供一种经接枝的抗体或其功能性片断，其包括在重链互补决定区（ＣＤＲ）的一个或多个ＣＤＲ中具有至少一个氨基酸替换的一个或多个ＣＤＲ，其中经接枝的抗体或其功能性片断对隐蔽胶原表位具有特异结合活性。本发明专利技术还提供一种使用对隐蔽胶原表位具有特异结合活性的抗体的方法，包括抑制血管生成、肿瘤生长及转移的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般性涉及免疫学且更具体而言涉及人源化的抗体及其用途。
技术介绍
细胞外基质(ECM)在正常和病理过程的调控中起主要作用。在ECM中所发现的表达最多的成份是胶原。已知三螺旋胶原对蛋白水解分裂作用抵抗力很强，除非通过基质金属蛋白酶(MMP)家族酶的成员进行该作用。血管生成和肿瘤生长取决于细胞与细胞外基质之间的相互作用。血管生成和肿瘤侵袭期间，皮内细胞和肿瘤细胞都经蛋白水解重塑其细胞外的微环境。然后这些侵袭性细胞与此新近重塑的细胞外基质相互作用，接着进行迁移和侵袭。所以，血管周围的基底膜主要成份是IV型胶原。另外，I型胶原是细胞间基质的主要成份。癌症进展主要的不利影响之一是在原发性肿瘤部位之外的转移。此转移常常需要更积极的治疗，并且转移一旦发生，那么癌症患者生存的预后急剧下降。所有实性肿瘤的生长都需要新的血管生长以用于肿瘤的连续扩张，尤其是最小尺寸之外的肿瘤连续扩张。因为肿瘤生长需要血管生成，所以抑制血管生成是抑制肿瘤生长的一种途径。因此，希望鉴别以血管生成的脉管系统为目标的分子。尤其引人注意的瞄准血管生成脉管系统的分子是能与血管生成脉管系统特异结合的抗体。然而，由于大多数抗体在非人类动物(例如小鼠)中发展出来，因此这些抗体经常具有限制其对人用治疗效能的不良致免疫活性。一种克服非人类抗体不良特性的途径是通过使用经剪接的人类抗体框架区序列和提供结合特异性的结合结构域一起来使抗体人源化。然而，这些被成为互补决定区(CDR)的结合结构域移植人类框架中经常导致结合亲合力的丧失。因此，需要鉴别对血管生成脉管系统具有特异性的抗体并需要人源化和优化用于治疗目的的抗体。以下专利技术满足了此需要并且也提供了相关优势。
技术实现思路
本专利技术提供经接枝的抗体或其功能性片断，包括在重链互补决定区(CDR)的一个或多个CDR中具有至少一个氨基酸替换的一个或多个CDR，其中经接枝的抗体或其功能性片断具有对隐蔽胶原表位的特异结合活性。本专利技术也提供使用对隐蔽胶原表位具有特异结合活性的抗体的方法，包括抑制血管生成、肿瘤生长及转移的方法。附图说明图1显示用于克隆编码HUIV26和HDI77抗体的核酸的引物的序列。图1A显示用于小鼠抗体重链的信号肽的一组5′引物(SEQ ID NO184-192)。图1B显示用于小鼠抗体重链的一组5′引物(SEQ ID NO193-211)。图1C显示用于小鼠重链及轻链恒定区的一组引物。引物2650(SEQ ID NO212)是用于小鼠κ轻链恒定区(氨基酸123-115)的3′引物。引物2656(SEQ ID NO213)是用于小鼠IgM CH1区域(氨基酸121-114)的3′引物。引物2706(SEQ IDNO214)是用于IgM CH1区域(氨基酸131-124)的3′引物。图2显示抗隐蔽胶原位点抗体HUIV26的可变区序列。图2A显示HUIV26可变区轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。图2B显示HUIV26可变区重链的核苷酸序列(SEQ ID NO3)。图2C显示HUIV26的HUIV26轻链(VK)结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO2)与人类可变区融合VKIV/JK2(SEQ ID NO6))的比对及HUIV26重链(VH)结构域(SEQ ID NO4)与人类可变区融合VHIII/JH6(SEQ ID NO8)的比对，其中CDR加了下划线。通过直线来表示框架区中在所述经比对的序列之间不同的氨基酸。图3显示抗隐蔽胶原位点抗体HUI77的可变区的序列。图3A显示HUI77可变区轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。图3B显示HUI77可变区重链的核苷酸序列(SEQ ID NO11)。图3C显示HUI77的HUI77轻链(VK)结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO10)与人类可变区融合(VKII/JK1(SEQ ID NO14))的比对及HUI77重链(VH)结构域(SEQ ID NO12)与人类可变区融合VHIII/JH6(SEQ ID NO16)的比对，其中CDR加了下划线。通过直线来表示在框架区中所对比的序列之间不同的氨基酸。图3D显示HUI77可变区的核苷酸序列与DPK13及JK1的人类框架融合的序列(SEQ ID NO17)的比对。图4显示用于抗隐蔽胶原位点抗体HUIV26的有益CDR突变。图4A显示用于在HUIV26的LCDR3及HCDR3中产生随机突变的一组引物(HUIV26LCDR3引物，SEQ ID NO224-232；HDIV26 HCDR3引物，SEQ IDNO233-243)。图4B显示在HDIV26的LCDR1a(SEQ ID NO266-273)、LCDR1b(SEQ ID NO274-282)、LCDR2(SEQ ID NO283-289)、HCDR1(SEQ IDNO290-294)、HCDR2a(SEQ ID NO295-303)及HCDR2b(SEQ ID NO304-311)中产生随机突变的一组引物。图4C显示HUIV26抗体的有益CDR突变。图5显示用于抗隐蔽胶原位点抗体HDI77的有益CDR突变。图5A显示用于在HDI77的LCDR3和HCDR3中产生随机突的一组引物。图5B显示用于在HUI77的LCDR1a(SEQ ID NO312-319)、LCDR1b(SEQ ID NO320-327)、LCDR2(SEQ ID NO328-334)、HCDR1(SEQ ID NO335-341)、HCDR2a(SEQID NO342-349)及HCDR2b(SEQ ID NO350-357)中产生随机突变的引物。图5C显示HUI77抗体的有益CDR突变。图6显示在HUIV26抗体的组合变体中的突变。显示了氨基酸的位置，以粗体显示了不同于野生型的突变。组合变体的相对活性显示为“SPEKon”和″SPEoff″(最后一列)。也显示了用于产生组合库的引物(SEQ ID NO163-173)。图7显示在HUI77抗体的组合变体中的突变。显示了氨基酸的位置，其中不同于以粗体来显示的野生型。组合突变的相对活性显示为“SPEKon”和″SPEKoff″(最后一列)。也显示了用于产生组合库的引物(SEQ IDNO174-18)。图8显示HUIV26变体的活性和特异性。显示了含有野生型HUIV26CDR和HUIV26变体2D4H1-C3及DhuG5的IX-IV26的经提纯的Fab对变性胶原IV(图8A)、变性胶原I(图8B)和天然胶原IV(图8C)的结合。图9显示HUI77变体的活性和特异性。显示了含有野生型HUI77CDR和HUI77变体Qh2b-B7及QhuD9的IX-I77的经提纯的Fab对变性胶原I(图9A)、变性胶原IV(图9B)和天然胶原I(图9C)的结合。图10显示HDIV26变体DhuH8的结合活性。显示了该抗体的Fab形式和IgG形式对变性(d-IV)和天然(n-IV)人类胶原IV的结合活性。图11显示HUI77变体QH2b对B16黑素瘤细胞增殖的影响。培养中生长的B16黑素瘤细胞未经处理(对照；方形)或者用QH2b变体的IgG形式来处理(圆形)。具体实施例方式本专利技术提供对隐蔽胶原部位特异的抗体，其中此部位在血管生成和肿瘤细胞侵袭期间经由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经接枝的抗体或其功能性片段，其包括在重链互补决定区（ＣＤＲ）或轻链ＣＤＲ的一个或多个ＣＤＲ中具有至少一个氨基酸替换的一个或多个ＣＤＲ，其中该重链ＣＤＲ选自ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、２８和３０，该轻链ＣＤＲ选自ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、２２和２４，所述经接枝的抗体或其功能性片断对隐蔽胶原表位具有特异结合活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JD沃特金斯，WD休斯，唐英，D布勒克，PC布鲁克斯，
申请(专利权)人：细胞基质公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]