可用于大规模生产的重组腺病毒伴随病毒生产方法及用途技术

本发明专利技术提出一种“一株载体细胞／一株辅助病毒”生产重组ＡＡＶ病毒的方法。其中载体细胞株是将含有外源基因表达单位的重组ＡＡＶ载体质粒导入哺乳动物细胞，经抗性筛选获得的整合了可拯救的重组ＡＡＶ ＤＮＡ的稳定传代的细胞株。辅助病毒是携带ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ基因的重组ＨＳＶ－１病毒。用这种全功能辅助病毒感染载体细胞株即可产生大量有感染性的重组ＡＡＶ病毒。本发明专利技术可用于重组ＡＡＶ病毒的规模化高效生产。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物技术专利
，涉及重组腺病毒伴随病毒的生产方法及获得的产品的用途，尤其是在基因治疗和转基因动物领域的用途。本专利技术是中国专利98101753.3(申请号)和98120033.8(申请号)的延续。基因传递系统(gene delivery system)是基因治疗研究和应用的核心技术，包括病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。其中腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)载体因其安全、稳定、既可感染分裂细胞又可感染不分裂细胞、感染效率高、可长期表达外源基因等优点而受到关注。AAV病毒是一种非致病性的微小病毒，基因组为4680nt的单链DNA。AAV病毒的生活周期有潜伏性感染和裂解性感染两种方式。AAV病毒的裂解性复制需要有辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)的参与。在没有辅助病毒存在时，AAV病毒以前病毒方式整合在宿主细胞染色体中。AAV基因组的末端分别有145nt的ITR序列，该序列是AAV病毒必需的顺式作用元件，在AAV病毒基因组的拯救、复制、包装和整合等功能中具有重要作用。两个ITR之间为反式作用的rep和cap基因，对AAV病毒DNA的复制和病毒颗粒的产生是必不可少的。Rep基因编码4种蛋白Rep78，Rep68，Rep52，Rep40，与AAV病毒的复制、整合、拯救等功能有关。Cap基因编码3种外壳蛋白，VP1，VP2，VP3，构成AAV的20面体外壳。Samulski RJ等(Cloning of adeno-associated virus into pBR322rescue of intact virus from therecombinant plasmid in human cells，Proc.Natl Acad.Sci USA，792077-2031，1982)将完整的双链AAV DNA克隆于pBR322质粒中，发现位于质粒中的AAV前病毒基因组亦具有感染性。因此将外源基因表达单位置于AAV病毒的两个ITR之间，而rep和cap基因及辅助病毒的功能则由其它方式反式提供，在细胞中可获得含有外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombinantadeno-associated virus，rAAV)。经典的rAAV产生方法是用双质粒共转染293细胞以及辅助病毒如5型腺病毒(Ad5)感染。双质粒中一个是重组AAV载体质粒，另一个为含有AAV rep/cap基因的辅助质粒。由于这种方法操作较复杂，影响rAAV产生的因素多，难以获得高滴度的rAAV，不易于扩大生产规模，因此许多研究者致力于改进rAAV的产生方法。这些改进包括以下几类1)将rep/cap基因转导到细胞株中，建成一种包装细胞系。其中的rep/cap的表达受其自身的启动子控制，或换成其它组成型或可诱导启动子。2)将AAV ITRs和其间的外源基因表达单位DNA插入腺病毒基因组中，构建成一种嵌合型重组腺病毒。3)将AAV ITRs和其间的外源基因表达单位DNA置于自主复制的EBV病毒载体中，转导至细胞中，建成一种携带具有自主复制能力的重组AAV载体质粒的细胞株。4)将rep/cap基因插入腺病毒基因组中，构建成一种具有完全辅助功能的重组腺病毒。然而许多实验证明，这种思路难以实现。可能是由于rep蛋白对腺病毒的强烈抑制作用使得含有rep/cap基因的重组腺病毒无法产生。5)用HSV病毒扩增子携带rep/cap基因，产生具有完全辅助功能的HSV混合病毒。尽管在rAAV产生方法上的各种改进都不同程度地提高了rAAV病毒的产量或简化了其制备方法，然而这些方法仍然没有很好地解决rAAV病毒的规模化高效生产问题。目前要制备足够人体试验用量的rAAV病毒成本(包括时间成本和资金成本)仍然极高。因此专利技术一种可用于大规模高效生产rAAV病毒的方法十分必要。本专利技术的目的在于提出一种可用于大规模制备的高效重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体的生产方法，即“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产方法。该方法具有产量高、操作简便、易于进行规模化和工艺化生产的特点。本专利技术可用来进行重组AAV病毒的大量生产，生产的重组AAV病毒可用于各种疾病的基因治疗。制备rAAV病毒的传统方法是用双质粒共转染293细胞及用辅助病毒(5型腺病毒)感染细胞。其中双质粒包括重组AAV载体质粒如pAB11和含有AAV rep/cap基因的辅助质粒如pAd8。这种方法由于要对细胞进行转染，因此具有转染效率低或不稳定、操作复杂、不易于扩大规模和工艺化的缺点。虽然经过改进，用磷酸钙共沉淀方法可使293细胞的转染效率达到或接近100％，但转染方法难以用于大量的细胞及对293细胞本身的要求(代次低于50代，细胞呈扁平状，倍增时间为36hr～48hr)限制了用该方法获得大批量的rAAV病毒。针对目前在rAAV生产中影响因素多、操作复杂、不利于规模化生产、从而难以获得高产量的rAAV病毒的弊病，本专利技术提出了“一株载体细胞/一株辅助病毒”的生产策略用携带了AAV病毒rep/cap基因的重组HSV-1病毒(HSV1-rc)感染稳定整合了重组AAV载体DNA的生产细胞株，从病变的细胞中可获得大量的rAAV病毒。HSV1-rc病毒可同时提供rAAV包装所必需的辅助病毒HSV-1及反式作用蛋白Rep及外壳蛋白，这两种功能通常是由野生型辅助病毒如Ad5或HSV-1及含有rep/cap基因的辅助质粒如pAd8提供。被包装进入重组AAV病毒颗粒中的重组AAV基因组DNA(单链)来源于重组AAV载体细胞株。重组AAV载体细胞基因组中稳定整合了一个或多个拷贝的重组AAV载体DNA，其中包含AAV病毒的两个ITR序列及位于其间的治疗基因表达单位。治疗基因表达单位由真核表达启动子(如HCMV IE启动子、SV40启动子、β珠蛋白基因启动子、可诱导启动子、各种组织特异性启动子等)、治疗基因、mRNA加尾信号组成，长度不超过5.0kb。用rHSV-rc病毒感染载体细胞株时，HSV1-rc病毒进入细胞后其DNA大量复制并最终产生子代病毒。HSV1-rc病毒DNA复制时携带的rep/cap基因亦同步复制，从而产生高拷贝的rep/cap基因。rep基因编码产生4种Rep蛋白(Rep78，Rep68，Rep52，Rep40)，使重组AAV载体DNA从细胞基因组上拯救出来并大量复制最终成为单链被包装到AAV壳粒中；cap基因编码3种外壳蛋白VP1，VP2，VP3，在细胞核内组装成壳粒。本专利技术产生rAAV病毒的过程与野生型AAV病毒在HSV-1为辅助病毒的情况下裂解性感染和增殖的过程十分相似，不同之处在于野生型的AAV病毒基因组的ITRs之间是rep/cap基因，辅助病毒是野生型的HSV-1；而本专利技术将rep/cap基因插入到辅助病毒HSV-1的基因组中，获得具有完全辅助功能的重组HSV-1病毒rHSV1-rc；AAV的ITRs及其间的治疗基因表达单位则由载体细胞株提供。用rHSV1-rc感染本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术属于生物技术专利技术领域，特别涉及用于基因治疗的重组腺病毒相关病毒载体（ｒＡＡＶ）的制备和用途。 本专利技术的特征是采用“一株细胞／一株病毒”的方法制备ｒＡＡＶ病毒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴小兵，伍志坚，侯云德，
申请(专利权)人：本元正阳基因技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]