哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的制备工艺，根据人源性Ｕ６启动子的序列进行引物设计，以ＨｅｐＧ２细胞的基因组ＤＮＡ为模板扩增目的基因得到ＰＣＲ产物，将ＰＣＲ产物经ＸｂａＩ和ＫｐｎＩ酶切后，与同样经ＸｂａＩ和ＫｐｎＩ酶切的ｐＵＣ１８在Ｔ４连接酶作用下连接，连接产物转化大肠杆菌ＸＬ－１０ｇｏｌｄ株，以质粒纯化试剂盒纯化重组质粒，用ＸｂａＩ和ＫｐｎＩ酶切鉴定，挑选酶切鉴定阳性的质粒测序，序列测定采用双脱氧链末端终止法，构建哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体ｐＵＣ１８Ｕ６，本载体可以在哺乳动物细胞内表达小干扰核糖核酸，抑制相应基因的表达，从而可以用于研究相应基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表达，则可用于治疗病毒性疾病和肿瘤等疾病。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于在哺乳动物细胞表达小干扰核糖核酸small interfering RNA，siRNA的制备工艺。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 1)根据人源性U6启动子的序列进行引物设计正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有Xba I和Kpn I酶切位点；2)扩增目的基因用胰酶消化处于对数生长期的HepG2细胞在800-1000rpm离心3-5分钟收集2×106-5×106个细胞；以200μL的磷酸盐缓冲液重悬收集的细胞，再依次加入20μL的蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AL，震荡混匀，在70℃下放置10分钟，再加入200μL浓度为96％-100％的乙醇，震荡混匀后，加入到2×106-5×106个DNeasyTMTissue Kit离心柱中，在8000-10000rpm离心1-2分钟后，再次加入500μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AW1，以8000-10000rpm离心1-2分钟，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AW2，在13000-14000rpm离心3-5分钟，将DNeasyTMTissue Kit离心柱放到一个干净的1.5mL-2mL的离心管中，加入200μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AE，室温下放置1-3分钟，在8000-10000rpm离心1-2分钟，再向DNeasyTMTissue Kit离心柱中加入200μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AE，室温下放置1-3分钟，在8000-10000rpm离心1-2分钟，得到HepG2细胞的基因组DNA；在PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl浓度为25mmol/L的MgCl2、4μl浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2细胞的基因组DNA和30μl的纯水，在94℃下5分钟后，于94℃下30秒、55-65℃下30秒、再于72℃延伸1-10分钟，共循环25-40次，然后在72℃延伸7-10分钟，得到PCR产物； 3)哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的构建与鉴定将PCR产物经DNA Fragment Purification Kit纯化回收，纯化的PCR产物经Xba I和Kpn I酶切后，与同样经Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4连接酶作用下连接，连接产物转化大肠杆菌XL-10gold株，以质粒纯化试剂盒纯化重组质粒，用Xba I和Kpn I酶切鉴定，挑选酶切鉴定阳性的质粒测序，序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行，构建成功的哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体命名为pUC18U6。其图谱和部分限制性内切酶位点见附图说明图1。本专利技术磷酸盐缓冲液包括0.14mol/L的NaCl、27mmol/L的KCl、101mmol/L的Na2HPO4和18mmol/L的KH2PO4其PH值为7.3。本专利技术通过分子生物学的手段，构建哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体pUC18U6，本载体可以在哺乳动物细胞内表达小干扰核糖核酸，抑制相应基因的表达，从而可以用于研究相应基因的功能；抑制病毒基因、癌基因等致病基因的表达，则可用于治疗病毒性疾病和肿瘤等疾病。具体的应用方式可参照目前已有的基因转染或基因治疗的方案。图中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，Plac为乳糖启动子，U6为人源性U6启动子，EcoRI、XbaI、KpnI为相应的酶切位点，Bp为碱基对。正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有Xba I和Kpn I酶切位点；1.2扩增目的基因用胰酶消化处于对数生长期的HepG2细胞在1000rpm离心5分钟，收集2×106个细胞，以200μL的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AL，震荡混匀，70℃放置10分钟，再加入200μL浓度为100％的乙醇，震荡混匀，加入到DNeasyTMTissue Kit离心柱中，在8000rpm离心1分钟，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AW1，以8000rpm离心1分钟，加入500μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AW2，在13000rpm离心3分钟，将DNeasyTMTissue Kit离心柱放到一个干净的1.5mL的离心管中，加入200μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AE，室温下放置1分钟，8000rpm离心1分钟，再向DNeasyTMTissue Kit离心柱加入200μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AE，室温下放置1分钟，在8000rpm离心1分钟，得到HepG2细胞的基因组DNA；在PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×PCR Buffer、3μl浓度为25mmol/L的MgCl2、4μl浓度为2.5mmol/L的dNTP、1μl的Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、5μl的HepG2细胞的基因组DNA和30μl的纯水，在94℃下5分钟后，于94℃下30秒、60℃下30秒、再于72℃延伸1.5分钟，共循环35次，然后72℃延伸7分钟，得到PCR产物；1.3哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的构建与鉴定将上述PCR产物经DNA Fragment Purification Kit纯化回收，纯化的PCR产物经Xba I和Kpn I酶切后，与同样经Xba I和Kpn I酶切的pUC18在T4连接酶作用下连接，连接产物转化大肠杆菌XL-10gold株，以质粒纯化试剂盒纯化重组质粒，用Xba I和Kpn I酶切鉴定，挑选酶切鉴定阳性的质粒测序，序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行。构建成功的哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体命名为pUC18U6。实施例21.1根据人源性U6启动子的序列进行引物设计正向引物5′GCGATCTAGAAAGGTCGGGCAGGAAGAG3′；反向引物5′GCGAGGTACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有Xba I和Kpn I酶切位点；1.2扩增目的基因用胰酶消化处于对数生长期的HepG2细胞，在800rpm离心3分钟，收集5×106个细胞，以200μL的磷酸盐缓冲液重悬细胞，再依次加入20μL蛋白酶K和200μL的DNeasyTMTissue Kit缓冲液AL，震荡混匀，70℃下放置10分钟，再加入200μL浓度为96％的乙醇，震荡混匀，加入到DNeasyTMTissueKit离心柱中，在10000rpm离心2分钟，再次加入500μL的DNeasyTMTissueKit缓冲液AW1，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的制备工艺，其特征在于：１）根据人源性Ｕ６启动子的序列进行引物设计正向引物：５′ＧＣＧＡＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧ３′；反向引物：５′ＧＣＧＡＧＧＴＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴ ＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＧ３′；正向引物及反向引物的５′端分别带有Ｘｂａ Ⅰ和Ｋｐｎ Ⅰ酶切位点；２）扩增目的基因用胰酶消化处于对数生长期的ＨｅｐＧ２细胞在８００－１０００ｒｐｍ转速下离心３－５分钟，收集２×１０↑［６］－５ ×１０↑［６］个细胞；以２００μＬ的磷酸盐缓冲液重悬收集的细胞，再依次加入２０μＬ的蛋白酶Ｋ和２００μＬ的ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ缓冲液ＡＬ，震荡混匀，在７０℃下放置１０分钟，再加入２００μＬ浓度为９６％－１００％的乙醇，震荡混匀后，加入到ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ离心柱中，在８０００－１００００ｒｐｍ转速下离心１－２分钟后，再次加入５００μＬ的ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ缓冲液ＡＷ１，以８０００－１００００ｒｐｍ转速下离心１－２分钟，加入５００μＬ的ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ缓冲液ＡＷ２，在１３０００－１４０００ｒｐｍ转速下离心３－５分钟，将ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ离心柱放到一个干净的１．５ｍＬ－２ｍＬ的离心管中，加入２００μＬ的ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ缓冲液ＡＥ，室温下放置１－３分钟，在８０００－１００００ｒｐｍ转速下离心１－２分钟，再向ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ离心柱中加入２００μＬ的ＤＮｅａｓｙ↑［ＴＭ］ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ缓冲液ＡＥ，室温下放置１－３分钟，在８０００－１００００ｒｐｍ转速下离心１－２分钟，得到ＨｅｐＧ２细胞的基因组ＤＮＡ；在ＰＣＲ聚合酶链式反应管中加入５μｌ的１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、３μｌ浓度为２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｇＣ ｌ↓［２］、４μｌ浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ、１μｌ的Ｔａｑ、１μｌ正向引物、１μｌ的反向引物、５μｌ的ＨｅｐＧ２细胞的基因组ＤＮＡ和３０μｌ的纯水，在９４℃延伸５分钟后，于９４℃延伸３０秒、５５－６５℃延伸３０秒、再于７２℃延伸１－１０分钟，共循环２５－４０次，然后在７２℃延伸７－１０分钟，得到ＰＣＲ产物；３）哺乳动物细胞小干扰核糖核酸表达载体的构建与鉴...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，郭颖，薛采芳，
申请(专利权)人：刘军，郭颖，薛采芳，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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