本发明专利技术涉及一种将人胰岛素样生长因子-1与人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合基因(IGF1-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。本发明专利技术旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的IGF1-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的IGF1-Fc蛋白。本项技术应用于IGF1-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种将人胰岛素样生长因子-I与人免疫球蛋白IgGl的Fe段融合基因(IGFl-Fc)转入哺乳动物细胞以大规模生产其蛋白产物的技术。
技术介绍
I. IGF-I蛋白的生物学作用与应用前景胰岛素样生长因子-I (IGFl)，又称为促生长因子(即somatomedin C)，是一种由生长激素诱导、通过旁分泌或自分泌方式产生的小分子细胞因子(约70氨基酸)，因其结构与胰岛素类似而得名，是生长激素发挥生理作用必须的一种活性蛋白，在生长发育及成人的合成代谢过程中发挥重要功能。IGFl对机体的生长发育至关重要。IGFl是生长激素首要的效应因子，在细胞生长、分化及损伤修复过程中发挥重要功能。IGFl是体内非常重要的细胞有丝分裂促进剂，IGFl与其受体IGFlR结合能够激活AKT信号通路，从而诱导细胞的分裂增殖，并抑制细胞程序性死亡；IGF1对于细胞分化相关蛋白的表达十分重要，其与某些生长因子协同作用可促进效应细胞的分化和成熟；IGF-1还参与创伤愈合的过程。实验证明，损伤的神经、肌肉和内皮细胞中IGF-I浓度增加。IGFl表达缺陷能引起个体发育不良甚至侏儒，例如Laron综合症。外源的重组IGFl能够矫正这种缺陷。IGFl自身可以作为药物用于与发育缺陷相关疾病的治疗。IGFl对于机体的代谢功能也扮演着重要角色。IGFl能促进糖原的合成和乳酸分泌并抑制糖原分解，增加集体对葡萄糖和氨基酸的吸收，，达到降低血糖的目的；IGF-1还能作用于脂肪细胞，促进脂肪分解和糖原合成，从而降低血脂水平。有研究表明，将IGFl用于胰岛素非依赖型的糖尿病患者能明显降低其血液中葡萄糖的浓度，疗效显著。另外，IGFl在骨的合成代谢中也发挥着重要的作用。IGFl可促进软骨细胞分裂增殖及软骨基质的形成，并刺激合成软骨基质特异型胶原蛋白-II型胶原；IGF1还能增强成骨细胞中某些代谢酶类的活性，对于骨的正常结构和功能是必需的。IGFl将用于骨质疏松症中防治能收到明显的效果。目前，国际上很多公司已经开展IGFl蛋白作为治疗药物的技术和产品开发，例如,Genentech,Cephalon,Chiron 等。Tercica 和 Insmed 公司的 IGFl 相关产品(Increlex和iPlex)已经通过美国FDA的审批上市。IGFl的过度表达与肿瘤的发生和发展有密切关系，临床研究证实人体多种肿瘤组织或血液中IGFl和或其受体的表达明显高于正常组织。在体内许多肿瘤，如肺癌、结肠癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌等肿瘤组织中高表达，其在外周循环中表达水平也升高。流行病学研究表明，循环中IGF-I水平升高与很多恶性肿瘤的发病率呈正相关，提示IGFl可能参与了某些肿瘤的发生发展过程。IGFl可望作为相关肿瘤的重要检测指标用于早期的诊断或预后的评价；另外，IGFl还可作为肿瘤治疗上的新靶点，阻断其产生、其与受体相互作用，或其信号通路的效应因子如癌基因的表达，对于阻断肿瘤细胞向周围组织的扩散转移或肿瘤的复发可能有重要意义。除此之外，IGFl还与其它一些疾病，如心脏病、脊髓侧索硬化症、衰老等关系密切。IGFl作为靶分子的研究将为许多疾病的早期诊断和治疗提供了新的方向，在药物研究及临床检验中具有广阔的市场前景。2. Fe融合蛋白的表达免疫球蛋白IgG的Fe融合蛋白是指在基因水平将目的基因同IgG的Fe片段基因相连而表达的重组蛋白，同时具有目的蛋白及免疫球蛋白的结构域，从而赋予了重组蛋白许多新的特性，拓展了蛋白在科研、制药及临床等方面的应用。在重组蛋白表达的过程中，Fe重组蛋白易于结合Protein A，从而简化了蛋白的纯 化过程；Fc片段可以方便地进行流式、免疫组化和免疫共沉淀等方法检测，可用于感兴趣的基因研究；体外实验中，Fe融合蛋白可用于拮抗或激活细胞表面受体用来研究受体-配体反应和信号通路；此外，Fe重组蛋白还能应用于噬菌体展示技术，如作为抗原制备人类全抗体库。另外，Fe片段还赋予了重组蛋白一些其它特性，增加了其在在制药和临床方面的应用价值。融合蛋白中加入重链的恒定区，其半衰期明显延长，延长了其在体内的半衰期；Fe段能穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用等；重组蛋白含有的铰链区结构域使其形成二聚体或多聚体，增强了其抗原结合力。以上这些特点拓展了融合蛋白在感染性疾病、自身免疫性疾病及移植排斥反应的治疗方面的临床应用前景。3.研究现状目前国际上生产的IGFl-Fc重组蛋白基本都是采用大肠杆菌或酵母表达系统获得的，蛋白产物未经糖基化或糖基化程度不高，活性和毒素含量难以满足临床诊断和治疗的目的。用哺乳动物细胞生IGFl-Fc重组蛋白是生产科研和临床用IGFl的重要途径，对于推动临床诊断环节的新型生物技术发展和临床药物开发具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术旨在建立用哺乳动物细胞大规模生产具有生物学活性的IGFl-Fc蛋白的方法。在工业生产中满足生产成本降低、简化工艺流程、提高产品产量和质量的总体要求。本专利技术包括制备转染用质粒和PEI、质粒转染293T细胞和表达、蛋白纯化及等四个步骤。用PEI作为转染试剂，其作为“质子海绵”可以高效地结合双链DNA，把其带入目的细胞中，蛋白产物可在短暂的时间(一般可以表达一周的时间)内获得一过性表达从而获得大量的蛋白。本专利技术所用的293T细胞是工业生产人临床用蛋白最为常见的一种细胞。不仅表达水平高，蛋白翻译后加工方式如糖基化等与体内天然蛋白相似，而且无潜在的生物危害性，自身分泌的蛋白很少从而简化了后续的纯化过程，特别适于分泌型细胞因子或趋化因子等产物的大规模生产。而且这种细胞可以通过驯化在无血清培养基中生产，对于降低工业生产的成本是必需的。细胞密度能够提高数十倍甚至数千倍，大大提高了蛋白产量。采用本方法，可以通过普通的大规模细胞培养获得大量高纯度高生物活性的IGFl-Fc蛋白。本项技术应用于IGFl-Fc蛋白的大规模生产，能够明显降低成本、简化工艺流程，提高产品产量和质量。附图说明图I是SDS-PAGE鉴定ProteinA亲和层析柱纯化后的IGFl-Fc重组蛋白SDS-PAGE电泳分析结果图(I.洗脱液E-I ;2.洗脱液E-2;3.洗脱液E-3 ;4. Prestained Marker ；5.还原条件下的E-I ；6.还原条件下的E-2;7.还 原条件下的E-3)图2是IGFl-Fc蛋白经superdex 200纯化柱纯化的峰3是SDS-PAGE分析IGFl-Fc蛋白经superdex 200纯化柱各管洗脱液电泳结果4是SDS-PAGE鉴定经superdex 200进一步纯化的IGFl-Fc蛋白电泳结果图具体实施例方式I.转染用质粒的制备用去除内毒素的质粒大提试剂盒(购自Qiagen公司)制备转染所需连有IGFl-Fc基因的表达质粒pR-IGFl-Fc。方法见说明书。用200 μ I TE缓冲液溶解质粒，紫外分光光度计测其浓度。2.转染用PEI的制备I)在500ml的烧杯中倒入450ml Milli-Q制备的超纯水；2)天平称量500mg线性PEI (购自Poly Science公司)，加入烧杯中，磁力搅拌器不断搅动；3)逐滴加入预先配好的12M浓HCl使其pH < 2. O (大约需要800 μ I)。搅本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柴笑梅，朱月珍，杨宣武，周慧芳，王小娟，江永海，
申请(专利权)人：江苏普罗赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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