生产蛋白质的细胞培养方法，其包括： ａ）在允许蛋白质产生的条件下培养在细胞培养中产生目标蛋白质的宿主细胞；和 ｂ）用Ｄ－半乳糖喂饲细胞。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及培养哺乳动物细胞的新的方法和过程，所述哺乳动物细胞产生蛋白质产物，优选具有增加和增强的唾液酸含量的糖基化蛋白质产物。细胞培养方法和过程在它们的多个方面的性能导致如通过唾液酸含量测量的产物的高数量和质量。
技术介绍
动物细胞培养，特别是哺乳动物细胞培养优选用以表达用于治疗和/或预防应用的重组产生的糖基化蛋白质。重组糖蛋白的糖基化模式是重要的，因为糖蛋白的寡糖侧链影响蛋白质功能，以及蛋白质的不同区域之间的分子内相互作用。这些分子内相互作用与蛋白质构象和糖蛋白的三级结构有关(见，例如，A.Wittwer等人，1990，Biochemistry，294175-4180；Hart，1992，Curr.Op.Cell Biol.，41017-1023；Goochee等人，1991，Bio/Technol.，91347-1355；和R.B.Parekh，1991，Curr.Op.Struct.Biol.，1750-754)。此外，寡糖基于特异细胞糖受体可以将特定多肽靶定到某些结构。(M.P.Bevilacqua等人，1993，J.Clin.I nvest.，91379-387；R.M.Nelson等人，1993，J.Clin.Invest.，911157-1166；K.E.Norgard等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901068-1072；和Y.mai等人，1993，Nature，361-555-557)。公知糖蛋白寡糖侧链的末端唾液酸成分影响糖蛋白的多种方面和性质，包括吸收、溶解性、热稳定性、血清半寿期、从血清的清除，以及其物理和化学结构/行为和其免疫原性(A.Varki，1993，Glycobiology，397-100；R.B.Parekh，Id.，Goochee等人，Id.，J.Paulson等人，1989，TIBS，14272-276；和A.Kobata，1992，Eur.J.Biochem.，209483-501；E.Q.Lawson等人，1983，Arch.Biochem.Biophys.，220572-575；和E.Tsuda等人，1990，Eur.J.Biochem.，188405-411)。通常基于哺乳动物细胞培养的系统中蛋白质表达水平比微生物表达系统，例如，细菌或者酵母表达系统中低得多。然而，细菌和酵母细胞在最佳地表达高分子量蛋白质产物、正确地折叠具有复杂立体结构的蛋白质，和/或提供必要的翻译后修饰使所表达的糖蛋白成熟的能力方面受到限制，从而影响产物的免疫原性和清除速度。由于培养动物或哺乳动物细胞，尤其产生重组产物的动物或者哺乳动物细胞的限制，已经研究了多种参数的操作，这些参数包括使用大规模培养容器；改变基本培养条件，如孵育温度、溶解氧浓度、pH等等；使用不同类型的培养基和向培养基加入添加剂；和增加所培养细胞的密度。此外，延长运行时间以增加终产物浓度而保持高产物质量的能力的发展将有益于哺乳动物细胞培养的方法开发。重要的产物质量参数是温度和多肽产物的糖基化结构的完全性，唾液酸含量通常用于糖蛋白质量的量度。细胞培养过程的运行时间，尤其非连续方法，通常受到细胞的剩余生存力的限制，所述剩余生存力通常随着运行过程减小。因此希望最大可能地延长高细胞生存力。产物质量的考虑也促使最小化存活细胞密度的减小并且保持高细胞生存力，因为细胞死亡可以释放唾液酸酶到培养上清液中，这可以减少所表达的蛋白质的唾液酸含量。蛋白质纯化考虑进一步促使最小化存活细胞密度的减小并且保持高细胞生存力。培养物中存在细胞碎片和死亡细胞的成分可以负面地影响在培养试验末端分离和/或纯化蛋白质产物的能力。通过培养中使细胞保持更长时间的存活，伴随着细胞蛋白质和酶对培养基的污染的减少，所述细胞蛋白质和酶为例如，细胞蛋白酶和唾液酸酶，它们可以导致细胞产生的所希望的糖蛋白的降解和最终质量降低。已经研究了实现细胞培养中高细胞生存力的多种参数。一种参数包括最初在37℃培养后仅降低培养温度(例如，Roess1er等人，1996，Enzyme and Microbial Technology，18423-427；T.Etcheverry等人的美国专利号5,705,364和5,721,121，1998；K.Furukawa等人的美国专利号5,976,833，1999；L.Adamson等人的美国专利号5,851,800，Genentech，Inc.的WO 99/61650和WO 00/65070；WO 00/36092 to Biogen，Inc.；和Girard等人的美国专利号4,357,422)。所研究的其他参数包括向培养基中加入组分。证明生长因子抑制剂苏拉明在CHO K1CycE的指数生长期间防止编程性细胞死亡(Zhangi等人，Biotechnol.Prog.2000，16，319-325)。然而，苏拉明不在死亡期保护细胞防止编程性细胞死亡。结果，苏拉明能够在生长期保持高生存力，但是不允许延长培养寿命。相同的作者报导对于CHO111-10PF细胞系，硫酸葡聚糖和硫酸聚乙烯类似于苏拉明可以相对于对照培养物增加第三天存活细胞密度和生存力。然而没有报导死亡期期间硫酸葡聚糖或者硫酸聚乙烯的作用。还报导苏拉明、硫酸葡聚糖和硫酸聚乙烯可以有效防止细胞聚集。已经向动物细胞培养基中补加肝素以便使依赖锚定的细胞系适应悬浮条件(例如，McKenna和Granados的美国专利号5,348,877，1994)。还公知肝素结合生长因子，如肝素结合类EGF生长因子(HB-EGF；Raab和Klagsbrun，Biochim.Biophys.Acta 1997，1333，F179-F199)。报导细胞表面硫酸类肝素蛋白聚糖(HSPG)增强HB-EGF结合和某些细胞类型(包括野生型CHO细胞)的生物活性(Raab和Klagsbrun，1997)。。对于结合肝素的生长因子EGF-2，已经提出对HSPG的结合增加细胞表面上局部FGF-2浓度，这又增加了FGF-2结合细胞的酪氨酸激酶受体的可能性(Raab和Klagsbrun，1997)。已经表明聚硫酸戊聚糖可以阻断培养的细胞上肝素结合生长因子的作用(Zugmaier等人，J.Nat.Cancer Inst.1992，84，1716-1724)。关于在动物细胞培养物中使用硫酸葡聚糖的专利文献涉及向培养基补加硫酸葡聚糖，目的是1)提高生长速度和增加人内皮细胞衰老前群体加倍的次数(Levine等人的美国专利号4,994,387和5,132,223，1991，1992)；2)增加哺乳动物细胞系中重组蛋白产率(Israel，1994的美国专利号5,318,898)；3)诱导昆虫细胞系中单一细胞悬浮(Shuler和Dee的美国专利号5,728,580，1996)；4)增加人肝细胞生长因子的生长促进活性和抑制其降解(Naka的美国专利号5,545,722和5,736,506，1996和1998)；5)增加存活细胞密度和重组蛋白质表达(Gorfien等人的WO 98/08934，1997)。在关于在培养基中存在或者补加硫酸葡聚糖的所有报导的情况中，在该给定培养基中整个培养时间内都存在硫酸葡聚糖。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：B·M·施林，S·冈洛夫，D·科塔里，K·莱斯特，L·马特洛克，S·G·泽加雷利，C·E·约斯滕，J·D·巴施，S·萨克哈穆里，S·S·李，
申请(专利权)人：布里斯托尔迈尔斯斯奎布公司，
类型：发明
国别省市：
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