一种智能腺病毒载体与ｋｈｐ５３抑癌基因的重组体及其应用，本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及人肿瘤抑制基因的重组病毒载体，特别是涉及一种由Ｋｏｚａｋ序列引导的人ｐ５３肿瘤抑制基因重组智能腺病毒载体，还涉及含有该基因重组载体的药物组合物。通过联合使用ＭＣＭＶ启动子、内含子以及Ｋｏｚａｋ规则序列等增强真核基因表达的元件，解决了ｐ５３基因表达量相对不足的问题；并采用ＡｄＭＡＸ ＨｉＩＱ重组腺病毒载体系统，解决了外源基因高表达重组腺病毒的有效包装问题，最终在真核细胞中经位点特异的同源重组，包装出Ｅ１、Ｅ３缺失的５型重组腺病毒ｒＡｄＭＨ－ｋｈｐ５３。应用本发明专利技术的重组腺病毒，可制备成临床使用的基因药物，用于多种恶性肿瘤的预防和治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及人肿瘤抑制基因的重组病毒载体，特别是涉及一种由Kozak序列引导的人p53肿瘤抑制基因重组智能腺病毒载体，还涉及含有该基因重组载体的药物组合物。
技术介绍
1、肿瘤基因治疗基因治疗是将有治疗作用的基因或DNA(RNA)片段通过一定方式导入人体靶细胞，针对导致疾病的各种分子病理变化，相应地在分子水平上调控基因的表达，从而发挥治疗作用，达到从根本上治疗疾病目的的分子医学治疗方法。十几年来，肿瘤基因治疗发展迅速。美国从1995年前后陆续成立了10大基因治疗公司，1999年约有30家基因治疗的专业公司，到2000年达到近100家，2004年全球240多家基因治疗公司中，有75家在进行肿瘤基因治疗的研究和开发；截止到2004年7月底，全世界五大洲23个国家批准的基因治疗临床试验方案达到了987个，其中针对肿瘤的基因治疗方案最多，共有656个，占总数的66.5％。给药途径有肿瘤组织内、静脉内、肝动脉内、皮下、肌肉、膀胱内、腹腔内等；世界上第一个上市的基因治疗药物正是用于肿瘤的治疗。尽管基因治疗的研究和应用起源于对遗传病的治疗，但近年来肿瘤基因治疗的发展却远远超过了遗传病，原因主要是肿瘤的发病率和患者人数远多于遗传病，据世界卫生组织报告，2000年全球新发恶性肿瘤病人1010万人，死亡620万人，现患恶性肿瘤病例2240万。过去的10年间，全球恶性肿瘤发病率增长了22％，它已经成为常见且严重威胁人们生命和生活质量的主要疾病之一，对人类健康威胁巨大，对患者身心造成的伤害严重；二是治疗基因的选择种类多，范围广，并不像遗传病那样局限于有缺陷的或突变的基因，只要能达到治疗肿瘤的目的而对正常人体细胞损伤小的基因均可采用，如肿瘤抑制基因、免疫增强基因、自杀基因、新生血管抑制基因等等；三是肿瘤的基因治疗不要求外源基因一定要持续表达，阶段性表达甚至一过性表达也可以达到杀伤肿瘤细胞的目的；四是多数肿瘤基因治疗方案是将治疗基因直接导入肿瘤细胞，对治疗基因表达调控的要求远不如遗传病治疗时严格。2、人p53基因研究进展 1979年Lane和Crawford等在SV40大T抗原基因转染的细胞中发现了p53基因，并认为其为癌基因。以后Hinds、Finlay等通过研究发现转染了myc或ras癌基因的细胞中，若存在野生型p53基因，则出现生长抑制。因此提出p53基因属于抑癌基因。人p53基因定位于第17号染色体17p13.1区，在基因组DNA上占据20303bp的长度，含11个外显子和10个内含子，编码393个氨基酸残基的蛋白质即P53蛋白。P53蛋白，从功能上可划分为五个部分N-末端的转录活化区(1-42 aa)能与一系列的蛋白结构(如MDM2 TBP TAFs)结合而调节p53的转录功能；信号区(64-92 aa)富含脯氨酸，有5个脯-X-X-脯重复顺序，此区不是转录活化所必须的，但对诱导细胞凋亡是必需的；DNA结合区(102-292 aa)识别顺序专一的DNA序列；四聚体化区(324-355 aa)此区能抑制癌细胞的生长；C-末端的非专一DNA结合区(370-393 aa)能与非特异性的DNA序列结合。p53的基本功能为核转录因子，其抗肿瘤的生物学活性主要表现在阻滞肿瘤细胞周期，可作用于G1/S期和G2/M期；诱导肿瘤细胞凋亡；抑制肿瘤血管生成；增强肿瘤细胞的免疫原性；抑制肿瘤细胞的侵润和转移；增加肿瘤细胞对放化疗以及热疗的敏感性等。p53基因突变是许多肿瘤发生的重要原因之一.基因突变主要包括点突变、等位基因的缺失、基因重排、与肿瘤病毒癌蛋白结合而失活等.据报道在大约200多种不同的肿瘤中有50％的肿瘤带有p53基因突变.已发现p53基因中有4个位于外显子5-8的突变热点，虽然不同组织器官发生的肿瘤中p53基因突变谱显示有差异，但约有90％的突变是集中在这部分区域。他们分别编码132-143 174-179 236-248和272-281号氨基酸。在多种人类肿瘤中，如食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、结肠及直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤中，p53基因的突变率都在50％左右。在黑色素瘤(原发)中p53基因突变率高达97％。肺癌中各型肺癌均存在p53基因突变，约52％的非小细胞性肺癌，90％的小细胞性肺癌存在p53基因突变。还有部分白血病、脑肿瘤、多发性骨髓瘤、星形细胞瘤也存在p53基因的改变。研究发现，难治的肿瘤p53基因突变率较高而相对容易治疗的肿瘤较少发生p53基因突变。而且p53基因的突变与病情的发展、肿瘤的转移以及对放疗化疗的敏感性和预后都关系密切。3、腺病毒载体研究进展腺病毒的形态是特征性的二十面体病毒壳体，无包膜，直径为70～90nm，有252个壳粒，其中20面体顶角壳粒为12个五邻体(penton)，每个五邻体有2条纤维。除五邻体外有240个非顶角壳粒，称为六邻体(Hexon)。腺病毒基因组是一个线性的双链DNA，长约36kb，其5’端与一种末端蛋白(TP)共价结合，5’端上还具有倒转末端重复序列(ITRs)。病毒DNA与核心蛋白VII和一个称为mu的小肽紧密结合。另一种蛋白V包被在DNA-蛋白复合物上，并且通过蛋白VI为DNA-蛋白复合物和病毒壳体间提供了结构上的联系。作为基因治疗载体的腺病毒基因组，通常是将其E1区和/或E3区删除，而将外源基因表达盒插入E1区的位置，这样构建的重组腺病毒是复制缺陷型的，即不能在一般的细胞中复制，而只能在特定的细胞中(如293细胞)复制生产。腺病毒载体的特点是载体容量较大(＞7.5kb)，转染效率极高(体外转染人肿瘤细胞可达100％)，生产效率高(病毒可在生产细胞上几百倍地扩增)，非整合性感染细胞，无遗传毒性，感染能力强(分裂，非分裂细胞均可被感染)，外源基因表达量高。这些特点使腺病毒特别适合于肿瘤的基因治疗及其制品的工业化生产。重组腺病毒载体毒种制备方法的演进早期采用双质粒共转染法即将带有目的基因的穿梭载体小质粒和带有腺病毒基因组的大质粒共同转染包装细胞——293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组，形成重组腺病毒载体基因组，并在293细胞内包装成病毒颗粒，此方法效率较低；Ad-Easy法即将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒转化携带了腺病毒大部分基因组质粒的细菌，在细菌Cre重组酶的作用下，重组获得重组腺病毒载体基因组的质粒，抗性筛选后，扩增，提取质粒，酶切纯化后转染293细胞，在其中包装成重组病毒颗粒，此法效率较高；AdMax法即将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，在重组酶的作用下，重组产生重组腺病毒，这是目前包装效率最高的方法。腺病毒载体携带的外源基因的表达往往会有一定的细胞毒性，甚至有时没有细胞毒性的基因的中度水平的表达也会明显阻碍腺病毒载体的复制和扩增，其导致的结果是病毒重组出毒困难，或难以扩增到高滴度。出现这种情况时，采用病毒单克隆筛选的方法也无法得到高表达目的蛋白的病毒。比如，表达糖蛋白的腺病毒往往难以出毒，类似的情况还有表达某些DNA结合蛋白或酶的腺病毒载体。所以很难预先估计某一株腺病毒载体的滴度和产量。AdMaxTMHi-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种智能腺病毒载体与ｋｈｐ５３基因的重组体，其特征在于，该重组体是利用ＤＮＡ重组技术，将人野生型ｐ５３基因ｃＤＮＡ改造为Ｋｏｚａｋ序列引导的人ｐ５３基因编码序列，并将其正向插入真核基因表达装置，最后在真核细胞中经位点特异的同源重组，构建成一个能在基因工程改造过的特定细胞中扩增、繁殖，也能在真核细胞中超高表达人ｐ５３基因的重组腺病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢庆军，
申请(专利权)人：北京乾景立康基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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