二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种接头序列，其选自SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：20中的至少两条。本发明专利技术还涉及到一种标签接头，其由接头序列以及DNA标签序列组成。本发明专利技术还公开了一种接头PCR引物组，每条接头PCR引物由上述的标签接头以及连接于标签接头3’端的连接序列构成，所述连接序列可将标签接头直接添加到目标基因片段的两端，从而构建测序文库。本发明专利技术提供的接头PCR引物，能够一次性在目标基因片段两端加上测序接头、样品标签和扩增引物，随后通过PCR富集即可得到测序文库，从而避免了常规建库过程中基因组DNA打断、纯化、末端修复、纯化、加A尾、纯化和接头连接的步骤，避免了反复多次操作及接头连接效率等诸多不稳定因素对构建文库质量的影响，大大提高了检测准确率。

Primers and methods for pretreatment of two generation sequencing samples, and kits

The invention relates to a joint sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:20 in at least two. The invention also relates to a label joint which is composed of a joint sequence and a DNA tag sequence. The invention also discloses a joint PCR primer set, each joint of PCR primers by the label and the joint is connected to the connector label sequence 3 'end of the constitution, the connection sequence tags can be added directly to the joint ends of target gene fragments, so as to construct the sequencing library. The joint PCR primers provided by the invention can be disposable at both ends of target gene fragment and sequencing joint, sample label and amplification primers and sequencing library can be obtained by PCR enrichment, thus avoiding the conventional genomic DNA in the process of building, repair, purification, interrupted end purification, A tail, purification and joint steps. To avoid repeated operation and joint efficiency etc. many unstable factors influence on the construction of library quality, greatly improve the detection accuracy.

【技术实现步骤摘要】
二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒。技术背景随着分子生物学、遗传学等学科的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术应运而生。第二代测序技术也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，synthesis)，例如，在合成新DNA互补链时，加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，或者直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号，通过荧光信号分析获得互加入碱基信息。现有的技术平台主要包括Roche的454平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer、AppliedBiosystems的SOLIDsystem以及lifetechnologies的PGM平台。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在科学研究和临床检测方面都有着广泛的应用。无论何种测序平台在测序前都要对样本进行处理，建立基因文库。不同的测序平台基因文库构建方法会有些差异，但基本可概括为以下几个步骤：获取基因组DNA，基因组DNA片段化，末端修复，连接接头，DNA片段选择，PCR扩增，扩增产物鉴定回收及纯化，纯化产物大小和浓度测定，符合要求的基因文库根据不同的测序平台要求制备测序模板，随后进行测序。常规的建库方法都需要较高浓度的起始核酸量，且操作步骤繁琐，需要经过预处理才能将测序接头连接到目的基因片段上，随后进行PCR扩增富集，费时费力，且接头连接效率直接影响构建文库的质量，所以并不适用于大规模临床样本及微量核酸样本的快速建库。因此，迫切需要一种能够简便、高效、快速和准确的建库方法，不仅适用于足量核酸样本的快速建库，同时可对特定的少量细胞群样本进行测序和突变分析，如特殊区域肿瘤组织细胞或血液中的循环肿瘤细胞等。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种接头序列，该接头序列可与包括但不限于扩增目标基因片段的引物以及转座子识别序列连接，可以通过PCR扩增或转座酶复合体直接添加到目标基因片段的两端，构建测序文库。实现上述目的的技术方案如下：一种接头序列，其选自SEQIDNO：1—SEQIDNO：20中的至少两条。本专利技术的另一目的是提供一种标签接头。实现上述目的的技术方案如下：一种标签接头，包括正向标签接头和反向标签接头，针对同一样品来源的标签接头包括有正向标签接头和反向标签接头，每条标签接头由5’的权利要求1所述的接头序列以及3’的用于表征样本来源的DNA标签序列组成，针对同一样品来源的标签接头中的接头序列不相同，同一样品来源的目标基因片段对应的DNA标签序列相同，且DNA标签序列中避免出现3个或3个以上单碱基重复序列；其GC含量在40％～60％之间；不同的DNA标签序列之间不存在非特异性结合；DNA标签与接头序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；DNA标签中不出现与接头序列相似度大于80％的序列。在其中一个实施例中，所述DNA标签选自SEQIDNO：21—SEQIDNO：50中的至少一条，针对同一样品来源的目标基因片段对应的DNA标签序列相同。本专利技术的另一目的是提供一种接头PCR引物。实现上述目的的技术方案如下。一种接头PCR引物，包括正向接头PCR引物和反向接头PCR引物，每条引物由上述标签接头以及连接于标签接头3’端的连接序列构成，所述连接序列可将标签接头直接添加到目标基因片段的两端，从而构建测序文库。连接序列包括但不限于扩增目标基因片段的引物或转座子识别序列。在其中一个实施例中，所述连接序列为针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的SEQIDNO：51，或所述连接序列为针对细菌Tn5转座子的SEQIDNO：52；或所述连接序列为选自针对CDH1基因的SEQIDNO：53和SEQIDNO：54，针对EGFR基因的SEQIDNO：55和SEQIDNO：56，针对HER2基因的SEQIDNO：57和SEQIDNO：58，针对KRAS基因的SEQIDNO：59和SEQIDNO：60，针对TP53基因的SEQIDNO：61和SEQIDNO：62中的至少一对。本专利技术的另一目的是提供一种接头PCR引物构建测序文库的方法。实现上述目的的技术方案如下。一种接头PCR引物构建测序文库的方法，主要包括以下步骤：A、提取样本中的DNA；B、根据上述接头PCR引物，将所述标签接头直接连接到的目标基因片段的两端，针对每种不同待测样本的接头PCR引物中DNA标签序列不同；C、PCR扩增富集目标产物，对目标基因扩增产物进行片段大小筛选和回收纯化，并将不同待测样本的目标基因扩增产物混合，构成核酸测序文库。在其中一个实施例中，所检测的样品数量为1-30个。在其中一个实施例中，所检测的样品数量为30个。本专利技术的另一目的是提供一种高通量测序的方法。实现上述目的的技术方案如下。一种高通量测序的方法，主要包括以下步骤：A、采用上述接头PCR引物构建测序文库的方法，构建核酸测序文库；B、对核酸测序文库进行片段大小检测和定量，确定测序稀释量。C、测序仪测序，以确定所述核酸测序文库的序列信息。本专利技术的另一目的是提供一种接头PCR引物构建测序文库的试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种构建测序文库的试剂盒，包含有：针对不同样本的不同接头PCR引物组；所述每一组接头PCR引物包含有至少一对接头PCR引物对，针对同一样品来源的接头PCR引物包括有正向接头PCR引物和反向接头PCR引物，每条接头PCR引物由标签接头和连接序列组成，所述标签接头由接头序列和DNA标签序列组成，所述同一接头PCR引物组的DNA标签序列相同，不同接头PCR引物组的DNA标签序列不同；每组接头PCR引物的接头序列选自SEQIDNO：1—SEQIDNO：20中的至少两条，DNA标签序列选自SEQIDNO：21—SEQIDNO：50；所述连接序列针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的序列，和/或所述连接序列为针对转座子识别序列连接而成，所述转座子识别序列可与相应的转座子序列发生特异性结合,和/或所述连接序列为扩增特定基因的特异性引物。在其中一个实施例中，所述连接序列为针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的SEQIDNO：51，或所述连接序列为针对细菌Tn5转座子的SEQIDNO：52；或所述连接序列为选自针对CDH1基因的SEQIDNO：53和SEQIDNO：54，或针对EGFR基因的SEQIDNO：55和SEQIDNO：56，针对HER2基因的SEQIDNO：57和SEQIDNO：58，针对KRAS基因的SEQIDNO：59和SEQIDNO：60，针对TP53基因的SEQIDNO：61和SEQIDNO：62中的至少一对。在其中一个实施例中，有30组接头PCR引物，每组接头PCR引物中的接头序列选自SEQIDNO：1—SEQIDNO：20中的两条；该30组接头PCR引物中的DNA标签序列选自SEQIDNO：21—SEQIDNO：50，每组内接头PCR引物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种接头序列，其特征在于，其选自SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：20中的至少两条。

【技术特征摘要】
1.一种接头序列，其特征在于，其选自SEQIDNO：1—SEQIDNO：20中的至少两条。2.一种标签接头，其特征在于，针对同一样品来源的标签接头包括有正向标签接头和反向标签接头，每条标签接头由5’的权利要求1所述的接头序列以及3’的用于表征样本来源的DNA标签序列组成，针对同一样品来源的标签接头中的接头序列不相同，同一样品来源的目标基因片段对应的DNA标签序列相同，且DNA标签序列中避免出现3个或3个以上单碱基重复序列；其GC含量在40％～60％之间；不同的DNA标签序列之间不存在非特异性结合；DNA标签与接头序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；DNA标签中不出现与接头序列相似度大于80％的序列。3.根据权利要求1所述的标签接头，其特征在于，所述DNA标签选自SEQIDNO：21—SEQIDNO：50中的至少一条，针对同一样品来源的目标基因对应的DNA标签序列相同。4.一种接头PCR引物组，其特征在于，针对同一样品来源的接头PCR引物组包括有正向接头PCR引物和反向接头PCR引物，每条接头PCR引物由权利要求2或3所述的标签接头以及连接于标签接头3’端的连接序列构成，所述连接序列可将标签接头直接添加到目标基因片段的两端，从而构建测序文库。5.根据权利要求4所述的接头PCR引物组，其特征在于，所述连接序列为针对全基因组预扩增引物的5’端非简并区的SEQIDNO：51，或所述连接序列为针对细菌Tn5转座子的SEQIDNO：52；或所述连接序列为选自针对CDH1基因的SEQIDNO：53和SEQIDNO：54，针对EGFR基因的SEQIDNO：55和SEQIDNO：56，针对HER2基因的SEQIDNO：57和SEQIDNO：58，针对KRAS基因的SEQIDNO：59和SEQIDNO：60，针对TP53基因的SEQIDNO：61和SEQIDNO：62中的至少一对。6.一种接头PCR引物构建测序文库的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：A、提取待检测样本中的DNA；B、根据权利要求4或5所述的接头PCR引物组，将所述标签接头通过连接序列直接连接到的目标基因片段的两端，针对每种不同待测样本的接头PCR引物中DNA标签序列不同；C、PCR扩增富集目标产物，对目标基因扩增产物进行片段大小筛选和回收纯化，并将不同待测样本的目标基因扩增产物混合，构成核酸测序文库。7.根据权利要求6所述的接头P...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志明，吴诗扬，廖传荣，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44