一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法技术

一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)检测准备：①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果不立即检测，将组织样本放置到?70℃的温度中保存；②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF?V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并进行定量；然后将突变型BRAF?V600E与野生型BRAF稀释后混合；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；③DNA引物和探针：所用的对应突变型BRAF?V600E的正向引物序列为：5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA?3；所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT?3；所用的BRAF的反向引物序列为：5?biotin?TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；所用的分子信标的序列为：5?FLUOROPHORE?GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC?QUENCHER?3；(2)检测程序：①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液；②准备以下检测反应混合物，体系20μl包含：所述的5×引物混合液中含有75％二甲基亚砜，突变型BRAF?V600E的正向引物(序列为5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA?3和BRAF的反向引物(序列为5?biotin?TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)各1mM，检测到的结果是突变型BRAF的含量；如果加入的引物是野生型BRAF正向引物(序列为5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT?3)和BRAF的反向引物(序列为5?biotin?TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)，那么检测到的结果就是野生型BRAF的含量；③将反应混合液(未加入样本)加入到微测试孔中，每孔19μl；④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10?100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；所述的酶混合物中含有：山梨醇、牛血清白蛋白、核糖核酸酶H、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶；⑤通过监测荧光信号来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF?V600E或者野生型BRAF的含量。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，步骤为：细胞裂解处理；RNA的逆转录处理；生成cDNA，并成为RNA扩增模板；通过定期监测荧光信号，来对RNA扩增子进行定量；本专利技术采用等温反应法，对BRAF的V600E突变位点进行定点特异检测，其中温度等温41℃进行，试验条件温和，反应化合物普通，操作简单，特异性高，仅需要能检测荧光探针的仪器即可。它有一个更高的放大系数，能够在1.5小时之内用2条针对靶向RNA的特异性引物和三个酶，制造出十亿个与目标RNA互补的RNA，通过荧光探针的检测，读出低至0.1％含量的BRAF突变信息，用于肿瘤患者靶向药物的用药指导。【专利说明】—种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法
本专利技术涉及一种基因突变的检测方法，具体是一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法。
技术介绍
BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤文氏肉瘤中发现并克隆确认的，是一个能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列，因其与CRAF和ARAF具有相当高的同源性，故称其为BRAF。BRAF癌基因编码的BRAF蛋白是有丝分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径蛋白，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化剂，在凋亡和增殖过程中起着重要作用，位于MAPK通路入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，调节细胞的生长、发育。近来研究发现，人类的许多恶性肿瘤中都有BRAF基因突变，BRAF作为分子标记在多种肿瘤的发生发展中充当着重要角色。英国肿瘤基因组计划的科学家Davies等对来自于530个不同肿瘤细胞株的基因组DNA进行筛查，结果证实有43株细胞发生了 BRAF基因突变。调查显示，大约有65%的结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤与该家族中的BRAF突变体有关。BRAF突变后持续性激活MAPK通路，使有丝分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化。RAF蛋白家族含有三个成员:aRAF，bRAF, cRAF，它们是在细胞外基质表达的一类保守的特异性丝/苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞外信号调节激酶(ExtracellularRegulated Kinase, ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)的信号级联传导途径。RAF激酶作用与RAS的下游，它的功能是磷酸化并激活MAPK /ERK激酶活性(MEK)。通过激活或者抑制Ras-Raf-MAPK / ERK信号通路，可以调控由于生长因子、细胞因子和激素介导的细胞增殖以及细胞存活。因此，对此通路不适当的激活和/或持续的激活会导致异常的细胞分化、增殖和凋亡，并且还会导致肿瘤的发生。人们通过在大量不同的恶性肿瘤组织中对BRAF进行测序，鉴定出30个以上单点缺失意义的突变，而大部分都发生在激酶区域。恶性黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中有50%含有bRAF突变，低度恶性卵巢癌中有30%，结肠癌中有15%，BRAF突变还存在于更多的癌症中(http: / / www.sanger.ac.uk / genetics / CGP / cosmic / )。而其中 90% 的BRAF突变都在600位存在缬氨酸被谷氨酸替代的现象(V600E)，这样的突变激活了 BRAF激酶，并引起了失控的细胞增殖以及癌症发生。当人们发现了这一点后，便开始研发生产出一些能够抑制BRAF突变的药物，并且在临床上应用上取得了重要的成果，比如威罗菲尼片(vemurafenib)，能对那些肿瘤表达原癌基因BRAF的病人起到非常好的效果。另一方面，在临床使用抗BRAF药物之前，进行肿瘤组织中BRAF基因型的鉴定是一件非常重要的事情。对病人BRAF基因的突变的金标准检测包括肿瘤组织样本的搜集，Sanger法测序或特异引物PCR法。基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。但是这种方法有一定的局限性，更多时候会涉及到更加复杂、费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism, SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis, HA)。以下是几种PCR衍生技术及经典突变检测方法。1、PCR-SSCP 法:PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70% -95%，片段大于400bp时，检出率仅为50%左右，该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因P53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85%以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大组织样本基因突变研究的筛选工作。2、异源双 链分析法(HA):HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100 %。3、突变体富集 PCR 法(mutant-enriched PCR):本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstN I位点，第13密码子有Bgl II位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)检测准备：①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果不立即检测，将组织样本放置到?70℃的温度中保存；②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF?V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并进行定量；然后将突变型BRAF?V600E与野生型BRAF稀释后混合；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；③DNA引物和探针：所用的对应突变型BRAF?V600E的正向引物序列为：5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA?3；所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT?3；所用的BRAF的反向引物序列为：5?biotin?TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；所用的分子信标的序列为：5?FLUOROPHORE?GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC?QUENCHER?3；(2)检测程序：①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液；②准备以下检测反应混合物，体系20μl包含：所述的5×引物混合液中含有75％二甲基亚砜，突变型BRAF?V600E的正向引物(序列为5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA?3和BRAF的反向引物(序列为5?biotin?TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)各1mM，检测到的结果是突变型BRAF的含量；如果加入的引物是野生型BRAF正向引物(序列为5?GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT?3)和BRAF的反向引物(序列为5?biotin?TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)，那么检测到的结果就是野生型BRAF的含量；③将反应混合液(未加入样本)加入到微测试孔中，每孔19μl；④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10?100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；所述的酶混合物中含有：山梨醇、牛血清白蛋白、核糖核酸酶H、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶；⑤通过监测荧光信号来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF?V600E或者野生型BRAF的含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张万明，易银沙，朱海强，李娜，刘彩云，袁炳秋，吴小宁，邹义洲，曹蓬荣，
申请(专利权)人：长沙赢润生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：