一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法技术

一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其特征在于共分两步：第一步：提取待测样品的基因组DNA；第二步：运用三对引物，包括一对通用引物、两对ARMS引物，进行三组实时荧光定量PCR反应；所述通用引物的序列为：上游引物：SEQ?ID?NO:15’CAG?AAG?GAA?GAG?AAT?ACT?TG3’下游引物：SEQ?ID?NO:25’TCG?AGC?AGT?TGA?GAA?TAG?TG3’所述第一对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ?ID?NO:1，下游引物为下列引物之一：SEQ?ID?NO:35’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTG?CG3’SEQ?ID?NO:45’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTG?AG3’SEQ?ID?NO:55’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTC?AG3’SEQ?ID?NO:65’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTT?AG3’SEQ?ID?NO:75’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GCG?AG3’SEQ?ID?NO:85’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GAC?TG3’所述第二对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ?ID?NO:1，下游引物为下列引物之一：SEQ?ID?NO:95’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTG?CA3’SEQ?ID?NO:105’GAG?CAG?TTG?AGAATA?GTGGA3’SEQ?ID?NO:115’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTCTA3’SEQ?ID?NO:125’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GAG?TA3’SEQ?ID?NO:135’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GACTA3’PCR反应体系的配制及扩增程序：⑴通用引物的扩增：反应混合液的配制：将浓度为5mM的通用引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR?GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL?DNA模板加在引物的上面一层，再加入上述PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；⑵第一对ARMS引物的扩增反应混合液的配制：将浓度为5mM的第一对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR?GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL?DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；⑶第二对ARMS引物的扩增反应混合液的配制：将浓度为5mM的第二对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR?GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL?DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；根据三组反应的循环阈值即Ct值，即可准确鉴定待测菌株是野生型还是H272Y突变型；上述PCR反应体系的配制及扩增程序中采用的dNTP均包括A,T,C,G四种核苷酸，四种核苷酸的浓度分别为6mM。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种基于ARMS的灰葡萄孢菌SdhB基因H272Y突变检测方法，其特征在于共分两步：第一步：提取待测样品的基因组DNA；第二步：运用三对引物，包括一对通用引物、两对ARMS引物，进行三组实时荧光定量PCR反应；所述通用引物的序列为：上游引物：SEQ?ID?NO:15’CAG?AAG?GAA?GAG?AAT?ACT?TG3’下游引物：SEQ?ID?NO:25’TCG?AGC?AGT?TGA?GAA?TAG?TG3’所述第一对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ?ID?NO:1，下游引物为下列引物之一：SEQ?ID?NO:35’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTG?CG3’SEQ?ID?NO:45’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTG?AG3’SEQ?ID?NO:55’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTC?AG3’SEQ?ID?NO:65’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTT?AG3’SEQ?ID?NO:75’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GCG?AG3’SEQ?ID?NO:85’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GAC?TG3’所述第二对ARMS引物的上游引物与通用引物的上游引物相同，为SEQ?ID?NO:1，下游引物为下列引物之一：SEQ?ID?NO:95’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTG?CA3’SEQ?ID?NO:105’GAG?CAG?TTG?AGAATA?GTGGA3’SEQ?ID?NO:115’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GTCTA3’SEQ?ID?NO:125’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GAG?TA3’SEQ?ID?NO:135’GAG?CAG?TTG?AGA?ATA?GACTA3’PCR反应体系的配制及扩增程序：⑴通用引物的扩增：反应混合液的配制：将浓度为5mM的通用引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR?GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL?DNA模板加在引物的上面一层，再加入上述PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；⑵第一对ARMS引物的扩增反应混合液的配制：将浓度为5mM的第一对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR?GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL?DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；⑶第二对ARMS引物的扩增反应混合液的配制：将浓度为5mM的第二对ARMS引物上游引物0.5μL与质量分数为20%的蔗糖溶液0.5μL、浓度为25×的SYBR?GreenⅠ1μL混合，加在PCR管的最底部，将5μL?DNA模板加在引物的上面一层，再加入PCR反应混合液，最上层加30μL矿物油封闭；此过程中不要晃动PCR管，使其保持分层；PCR反应条件：94℃3分钟；95℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，收集荧光，共40个循环；根据三组反应的循环阈值即Ct值，即可准确鉴定待测菌株是野生型还是H272Y突变型；上述PCR反应体系的配制及扩增程序中采用的dNTP均包括A,T,C,G四种核苷酸，四种核苷酸的浓度分别为6mM。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢飞，吕宝北，马雪梅，江洪，刘珊珊，
申请(专利权)人：北京工业大学，北京泰格瑞分子检验有限公司，
类型：发明
国别省市：