一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法技术

本发明专利技术公开了一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，步骤如下：CTC细胞分离及培养；辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液；分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈；回输治疗：将加有DC和CIK细胞等物质的生理盐水采用静脉滴注的方式回输给患者。本发明专利技术设计出了完美的利用医疗中检测和分离循环肿瘤细胞的技术，用于结合现代DC、CIK为基础的过继免疫治疗技术，本发明专利技术具有多项优点：1、提前检测循环肿瘤细胞，提前治疗肿瘤的优点；2、只需要几毫升血液即可分离出CTC，靶向抗原获取容易的特点；3、对于肿瘤术后不定期进行针对患者特异性的肿瘤治疗，具有针对性强且准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法
本专利技术涉及一种肿瘤治疗领域，具体是一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治 疗方法。
技术介绍
肿瘤细胞迁移：恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其 他部位继续生长，称肿瘤转移。良性肿瘤无转移。恶性肿瘤容易发生转移，其方式有四种： ①直接蔓延到邻近部位；②淋巴转移：原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋 巴结，也可能超级转移；或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展 时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组织淋巴 引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿；③血行转移：癌细胞进入血管随血流转移至 远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继发性肿瘤；④种植：瘤细胞脱落后种植到另一部位， 如内脏的癌播种到腹膜或胸膜上。显然，恶性肿瘤转移将增加对机体的损害作用，而且影响 转归。 树突状细胞（Dendritic cells，DC) :DC 细胞，1973 年 Steiman 和 Cohn 首次从 脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞形态和功都不同的白细胞，因其细胞膜 向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树状突起，故而命名为树突状细胞（dendritic cells，DCs)。它是机体功能最强的专职抗原递呈细胞（Antigen presenting cells，APC), 它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激 活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC与肿瘤的发生、发展有着 密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心 是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。美国杜 克大学遗传和细胞治疗学中心的研究主任埃利-吉尔波瓦说过：DC是激发机体免疫系统 激发抵御癌症侵袭最有效的途径之一。 DC作为高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导 针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。 CIK细胞（cytokine induced killer):最初是指在正常人体外周血中只占1? 5%的cd3+cd56+的t淋巴细胞。目前国内外制备的用于过继免疫治疗的cik细胞，实际 上是体外扩增出的以cd3+cd56+、cd3+cd8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种细胞 因子如il-2、ifn-γ及某些单克隆抗体（anti-cd3mcab)的刺激下，由从外周血、骨髓或脐 血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非mhc限制的极强的溶瘤活 性。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK)是一种新型的 免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞（自然杀伤细胞）样T淋巴细胞，兼具有T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别 能力很强，如同细胞导弹，能精确点射肿瘤细胞，但不会伤及无辜的正常细胞。尤其 对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发， 提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。 循环肿瘤细胞：循环肿瘤细胞（circulating tumour cell)，通常把进入人体外周 血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。肿瘤细胞的一个特征是细胞间的黏附力非常弱，因此肿 瘤细胞就有可能从瘤体脱落，如果脱落的部分进入了血液循环，即可成为循环肿瘤细胞。此 类细胞可以随着血液循环到远处种植形成转移，也可以与凝血系统作用形成血栓，也有研 究说此类细胞可以刺激人体免疫系统可能对肿瘤的治疗有研究意义。 早在1896年，Ashworth曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤 的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC)的概念。 肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形 成临床转移灶提供了可能。CTC指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿 瘤细胞的不断增殖，部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质，增加其运动能 力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主 结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。Louha等报道， 在肝癌患者手术中牵动肝脏易发生医源性肿瘤细胞扩散，其原因可能是肝脏具有海绵状结 构，牵动肝脏可使器官伸展和压缩。 进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡。宿主的免疫识别和机械杀伤作用以 及肿瘤细胞自身因素，如缺乏变形性以致不能顺利通过循环管道系统，或缺乏形成癌栓能 力等均可导致肿瘤细胞死亡。只有极少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环 系统中存活下来，相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶。因此，在外周血 中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移。 随着对CTC研究的深入，人们发现检测CTC有助于建立个体化的治疗方案。 Beitsch等采用流式细胞计数、免疫化学等方法比较早期及晚期乳腺癌患者CTC的水平，明 确发现转移性乳腺癌比早期乳腺癌有更多的CTC。通过这种方法能够筛选出高危患者，决 定是否需要辅助治疗。Bela等研究认为，CTC数量的改变可以反应肿瘤对治疗的敏感性及 其增殖活性，可为个体化治疗提供依据。最近，Cristofanilli等检测117例进展期乳腺癌 患者CTC在治疗前后的变化情况，发现CTC水平可以预测进展期乳腺癌的治疗效果。CTC 水平在治疗前较低或开始治疗之后降低的女性治疗效果好，而在治疗后CTC水平仍较高的 患者与前者相比，疾病进展迅速，生存期短，治疗效果差。传统的临床评定疗效方法是根据 肿瘤的大小变化，需要在开始治疗之后3?4个月进行，而且需要进行一系列检查如ECT、 X线等。而Cristofanilli等的研究显示通过检测转移性乳腺癌患者CTC水平可以在最初 治疗之后3?4周尽早预测疗效。这对于决定患者的个体化治疗具有重要意义。已有研究 表明检测早期乳腺癌患者骨髓微转移情况可以监测辅助治疗效果，而在考虑给予辅助治疗 的问题上，CTC在转移性乳腺癌中的重要作用可能与骨髓微转移在早期乳腺癌中的作用类 似。目前有学者正研究能否根据CTC水平改变治疗方案藉以提高疗效，如根据其检测结果， 结合病人的具体情况选择适宜的辅助治疗，调整治疗强度、持续时间，尽量使病人免受不必 要的毒性作用。 循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体 化治疗包括临床筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。 1、体检：（体外早期诊断）。对于肿瘤的常规检测手段来讲，例如影像学。肿瘤在 小于一公分的情况下，医生也不认为它是异常。通过国外发表的文章可以看到，不要说是一 公分，很多肿瘤在一个毫米的情况下已经在血液里查到循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC‑CIK治疗方法，其特征在于，步骤如下：(1)CTC细胞分离及培养；(2)辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液；(3)分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈；(3.1)血液中分离单核细胞(3.1.1)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中；(3.1.2)300g离心10min，离心后，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管中，56℃水浴灭活30min，再于400g离心10min后，收集上层黄色液体即低血小板血浆，4℃储存备用；(3.1.3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合液，用移液器混匀；(3.1.4)再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；(3.1.5)400g离心20分钟；(3.1.6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中；(3.1.7)用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞；(3.1.8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞；(3.2)免疫细胞诱导分化及抗原递呈；(3.2.1)第0天，离心收集单核细胞，用20ml无血清培养基重悬，在T75培养瓶中培养2h；(3.2.2)2h后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用无血清培养液补足T175培养瓶的培养液到50ml，并加入终浓度1000U/ml的白介素2(IL‑2)和终浓度25ng/ml的抗CD3单抗；同时，向T75培养瓶中加入DC培养基和2ml辐照处理的CTC细胞悬液；(3.2.3)第二天，对T175培养瓶进行半量换液；(3.2.4)第四天，对T75培养瓶中的细胞用DC培养基，进行半量换液，并补加2ml处理后的CTC细胞悬液；同时，T175培养瓶中补加培养液到100ml；(3.2.5)第六天，向T75培养瓶中，加入终浓度20ng/ml的TNF‑α。补加培养液到300ml；(3.2.6)第八天，用细胞刮刀刮下T75培养瓶中的DC细胞，加入到CIK细胞中，并补加5ml处理后的CTC细胞悬液，再将培养液补加到500ml，进行混合扩增培养；(3.2.7)第十天，将所有的DC和CIK细胞离心后，用生理盐水洗2次(300g，离心5分钟)，最后，加入到注射用生理盐水中，补加10％人血白蛋白；(4)回输治疗：将加有DC和CIK细胞等物质的生理盐水采用静脉滴注的方式回输给患者。...

【技术特征摘要】
1. 一种术后节制肿瘤细胞迁移的DC-CIK治疗方法，其特征在于，步骤如下： (l)CTC细胞分离及培养； ⑵辐照处理CTC细胞，制备靶向悬液； ⑶分离PBMC，并诱导DC细胞和CIK细胞，进行CTC悬液靶向抗原递呈； (3. 1)血液中分离单核细胞 (3. 1. 1)取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中； (3. 1.2) 300g离心lOmin，离心后，将所有的上层血浆转移到2个新的无菌离心管中， 56°C水浴灭活30min，再于400g离心lOmin后，收集上层黄色液体即低血小板血浆，4°C储存 备用； (3. 1. 3)向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合 液，用移液器混匀； (3. 1. 4)再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合液用移 液器转移到淋巴细胞分离液的上层； (3. 1. 5)400g 离心 20 分钟； (3. 1. 6)离心后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中； (3. 1. 7)用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，清洗单核细胞； (3. 1. 8)重新加入注射用生理盐水45ml，混匀后离心清洗单核细胞； (3. 2)免疫细胞诱导分化及抗原递呈； (3. 2. 1)第0天，离心收集单核细胞，用20ml无血清培养基重悬，在T75培养瓶中培养 2h ； (3. 2. 2) 2h后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用无血清培养液补足T175 培养瓶的培养液到50ml，并加入终浓度1000U/ml的白介素 2 (IL-2)和终浓度25ng/ml的抗 ⑶3单抗；同时，向T75培养瓶中加入DC培养基和2ml辐照处...

【专利技术属性】
技术研发人员：易银沙，张万明，朱海强，邹义洲，许澎，刘彩云，袁炳秋，吴小宁，
申请(专利权)人：长沙赢润生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43