检测基因表达量的引物、探针和试剂盒、及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种检测基因表达量的引物、探针和试剂盒、及其使用方法，本发明专利技术还公开了包括有该引物、探针的试剂盒及其使用方法。所述引物序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:8所示，所述探针序列如SEQ?ID?NO:11～SEQ?ID?NO:14所示，所述试剂盒包括有上述引物和探针、内参基因的引物和探针、实时荧光定量PCR?MIX反应液、去离子水、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。本发明专利技术可以对上述四个基因的表达量进行检测，检测面广，检测流程简单快捷，有助于医生对患者的用药策略进行综合分析、判断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，涉及基因检测的引物、探针和试剂盒，尤其涉及一种检测ERCCl、RRMl、TUBB3、TYMS基因表达量的引物、探针和试剂盒、使用方法及应用。
技术介绍
随着医学研究和药物研发水平不断进步，越来越多的治疗肿瘤类药物被开发出来，但是，一些患者在使用某些药物进行治疗时效果并不理想，表现为肿瘤对药物敏感度低，耐药性强等，研究表明这一现象与人体内的某些基因过表达有关。钼类药物是最常用的肿瘤化疗药物之一，它主要通过引起肿瘤细胞内DNA的交联形成加合物，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。ERCCl是核酸切除修复系统NER (nucleotide excision repair)的一个关键基因，NER可以切除加合物并修复被损伤的DNA，从而降低化疗效果，因此，ERCCl在mRNA中的高表达与钼类药物的耐药性有关。吉西他滨是临床上用来治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌及其他实体肿瘤的一种抗肿瘤药物，药物进入细胞后，可通过一系列的磷酸激酶活化，生成三磷酸核苷类似物，与DNA合成的底物竞争从而掺入DNA链，中断DNA的合成。临床研究表明，RRMl基因的表达水平与吉西他滨疗效负相关，RRMlmRNA表达水平低的非小细胞肺癌患者，在接受吉西他滨和钼类药物联合化疗后有较好的应答，其中位总生存期也比RRMlmRNA表达水平高的患者长，此外，RRMl在胰腺癌中的高表达也会导致患者对吉西他滨产生抗性，美国国家综合癌症网络非小细胞肺癌临床实 践指南(2011)已经将RRMl表达水平作为治疗的预测生物标记，因此，检测RRMl表达水平对于预测吉西他滨的疗效是非常必要的，RRMl表达水平低的患者采用吉西他滨为主的化疗疗效较好。抗微管类化疗药物是作用于细胞微管，通过影响纺锤体形成，从而抑制细胞有丝分裂的一类光谱化疗药，细胞内微管蛋白分为α、β两个亚型，是细胞骨架的中药组成部分，是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位，也是抗微管药物的主要作用靶点。据研究显示，TUBB3基因编码的β-Tubulin-111(3型β微管蛋白)与抗微管化疗药敏感性的关系最密切，低TUBB3mRNA表达水平的肿瘤患者接受抗微管类药物化疗的效果较好，中位生存期较长，反之，高TUBB3mRNA表达水平的肿瘤患者的抗微管类药物化疗疗效较差。氟类药物是尿嘧啶的氟代衍生物，可在细胞内转变为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)，从而抑制脱氧核苷酸合成酶，阻止脱氧核苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，进而影响DNA的合成，另外，也能掺入RNA中干扰蛋白质的合成，从而达到抑制肿瘤生长的作用。TYMS (Thymidylate Synthetase)基因编码的胸苷酸合成酶(TS)是嘧唳核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，同时它是氟类药物在体内作用发挥细胞毒作用的目标酶，氟类药物在体内转化为5-FU，5-FU的代谢物与TS结合，阻碍TS的正常功能，从而抑制DNA合成。众多临床研究结果都显示TYMS基因的mRNA表达水平与氟类药物疗效密切相关，低TYMS mRNA表达水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，反之，TYMS高表达的患者接受氟类药物化疗的效果较差。上述研究结果都表明，在一线治疗的恶性肿瘤患者中检测ERCC1、RRMU TUBB3和TYMS基因的表达量具有重要的临床意义，是正确对患者用药治疗的先决条件。过去对上述四个基因表达量的检测方法主要通过Nothern blot法，该方法需要提取RNA，使用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物上，再用放射性(或非放射性)标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影(或化学显影)，以目标RNA所在位置标示其分子量的大小，以显影强度提示目标RNA在所测样品中的相对含量。这个方法繁琐费时，而且对RNA要求较高，并且RNA非常容易降解，致使结果不稳定，灵敏度不高，需要的样本RNA量非常大才能保证检测结果。目前实时荧光定量PCR技术蓬勃发展，它是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该技术不仅实现了 PCR的定量检测，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于检测ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表达量的引物和探针，本专利技术还公开了包括有该引物、探针的试剂盒及其使用方法。本申请的专利技术人在GenBank检索ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因的信息，根据检索到的基因编码序列，在基因的保守区设计引物和探针，其中探针的两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)，通过实时荧光定量PCR扩增来快速检测待测样本中ERCC1、RRMUTUBB3和TYMS基因的表达情况，可以准确、快速、灵敏地检测出ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因的表达量。根据本专利技术的实施例，提供了一种用于检测ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表达量的引物和探针，所述引物序列如下:SEQ ID N0:15’-ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT-3’SEQ ID N0:25’-CATCTGGGCACTGAAAGGGA-3’SEQ ID N0:35’-ACTAGCTGATGCATGTGA-3’SEQ ID N0:45’-TCCATAACAAATTCTGGATTCG-3’SEQ ID N0:55’-GCGGGAGGGATTTGGATT-3’SEQ ID N0:65，-GGAAGGGTGGTTCCAGGC-3，SEQ ID N0:75’-GAGGCGGTGGAGCACATTT-3’SEQ ID N0:85，-CGTTTGTTGTGAGCAGAGG-3，所述探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述探针的序列如下，其中，R表不突光报告基团，Q表不突光淬灭基团:SEQ ID NO: 115，-R-ACGCCCTAGCTCACTCCCCT-Q-3 ’SEQ ID NO: 125’-R-GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA-Q-3’SEQ ID NO: 135，-R-AAAGTTGTCTGGCTCCAA-Q-3’SEQ ID NO: 145’-R-CTGGCACCTGTCGGTGTT-Q-3’。根据本专利技术的实施例，还提供了一种用于检测ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因表达量的试剂盒，其主要包括:DERCCU RRMU TUBB3和TYMS基因检测的引物和探针，其中，引物序列如SEQ IDNO:1 ~SEQ ID NO:8 所示，探针序列如 SEQ ID NO: 11 ~SEQ ID NO: 14 所示；2)内参基因的引物和探针；优选的，内参基因为ATCB基因，该基因的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，探针序列如SEQ ID NO: 15所示，所述探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。3) ATCB、ERCC1、RRM1、TUBB3和TYMS基因的标准品，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物和探针，其特征在于，所述引物的序列如下：SEQ?ID?NO:15’?ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT?3’SEQ?ID?NO:25’?CATCTGGGCACTGAAAGGGA?3’SEQ?ID?NO:35’?ACTAGCTGATGCATGTGA?3’SEQ?ID?NO:45’?TCCATAACAAATTCTGGATTCG?3’SEQ?ID?NO:55’?GCGGGAGGGATTTGGATT?3’SEQ?ID?NO:65’?GGAAGGGTGGTTCCAGGC?3’SEQ?ID?NO:75’?GAGGCGGTGGAGCACATTT?3’SEQ?ID?NO:85’?CGTTTGTTGTGAGCAGAGG?3’所述探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述探针的序列如下，其中，R表示荧光报告基团，Q表示荧光淬灭基团：SEQ?ID?NO:115’?R?ACGCCCTAGCTCACTCCCCT?Q?3’SEQ?ID?NO:125’?R?GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA?Q?3’SEQ?ID?NO:135’?R?AAAGTTGTCTGGCTCCAA?Q?3’SEQ?ID?NO:145’?R?CTGGCACCTGTCGGTGTT?Q?3’。...

【技术特征摘要】
1.一种引物和探针，其特征在于，所述引物的序列如下:SEQ ID NO:15’ -ATGGCCCTCACGGAGTTTTGT-3’SEQ ID NO:25’ -CATCTGGGCACTGAAAGGGA-3’SEQ ID NO:35’ -ACTAGCTGATGCATGTGA-3’SEQ ID NO:45’ -TCCATAACAAATTCTGGATTCG-3’SEQ ID NO:55’ -GCGGGAGGGATTTGGATT-3’SEQ ID NO:65’ -GGAAGGGTGGTTCCAGGC-3’SEQ ID NO:75’ -GAGGCGGTGGAGCACATTT-3’SEQ ID NO:85’ -CGTTTGTTGTGAGCAGAGG-3’ 所述探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，所述探针的序列如下，其中，R表不突光报告基团，Q表不突光淬灭基团:SEQ ID NO: 115’ -R-ACGCCCTAGCTCACTCCCCT-Q-3’SEQ ID NO:125’ -R-GCCGCCAAGAAAGTCATGTTTGA-Q-3’SEQ ID NO:135’ -R-AAAGTTGTCTGGCTCCAA-Q-3’SEQ ID NO:145’ -R-CTGGCACCTGTCGGTGTT-Q-3’。2.一种包括有权利要求1所述的引物和探针的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: DERCCU RRMU TUBB3和TYMS基因检测的引物和探针，其中，引物序列如SEQ IDNO:1 ~SEQ ID NO:8 所示，探针序列如 SEQ ID NO: 11 ~SEQ ID NO: 14 所示； 2)内参基因的引物和探针； 3)内参基因、ERCC1、RRMUTUBB3和TYMS基因的标准品，所述标准品为分别含有内参基因、ERCCl、RRMl、TUBB3和TYMS基因编码序列的重组质粒载体； 4)实时荧光定量PCRMIX反应液、去离子水； 5)分隔并集中包装上述试剂的瓶或管以及包装盒。3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述内参基因为ATCB基因，所述ATCB基因的引物序列如SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示，探针序列如SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳春，侯然，程宇，刘晓峰，朱立文，梁超，王绪华，方国伟，黄士昂，陈忠，
申请(专利权)人：北京海思特临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：